劉忠梁 李 戈 宋燕燕 崔 彬 苑海濤

(山東大學附屬省立醫(yī)院心內(nèi)科，濟南 250021)

病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VCM)是危害人類特別是青少年的常見心臟病之一，是40歲前成人猝死的主要原因。部分VCM患者可轉(zhuǎn)化為擴張型心肌病(Dilated cardiomyopathy，DCM)，導致心室擴大及心功能進行性惡化，已成為危害人類健康的常見心臟疾病。有研究顯示，病毒感染后誘發(fā)的自身免疫損傷在VCM的發(fā)生發(fā)展及向DCM轉(zhuǎn)化的過程中起重要作用［1］。實驗性自身免疫性心肌炎(Experimental autoimmune myocarditis，EAM)是一種由心肌肌凝蛋白誘導產(chǎn)生的自身免疫性疾病模型，其發(fā)病機制和病理特征與人類VMC和DCM相似，常作為研究心肌炎的動物模型［2］。B7-H4是B7家族的新成員［3］，參與調(diào)解T-B細胞相互作用而下調(diào)B細胞產(chǎn)生抗體，并參與調(diào)節(jié)效應T細胞的功能及維持外周耐受。已有文獻報道，在狼瘡腎炎［4］、類風濕關(guān)節(jié)炎［5，6］等自身免疫性疾病中，病變組織中有B7-H4蛋白的出現(xiàn)，提示B7-H4可能參與了這些疾病的發(fā)病過程。本實驗擬通過建立EAM模型，用免疫組織化學染色、ELISA、Real-time PCR(Realtime PCR)等方法，觀察B7-H4在心肌炎病程中表達的變化情況，以期為心肌炎的發(fā)病機制提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料 豬心肌肌凝蛋白、完全弗氏佐劑、刀豆蛋白A(Con A)均購自美國Sigma公司;Anti-B7-H4抗體購自 abcam公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Applied Biosystems公司;Real-time PCR試劑盒購自美國Agilent Technologies公司;引物由日本TaKaRa公司設計合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 4周齡雄性BALB/c小鼠72只，平均體重13～16 g，純種近交系，購自山東大學醫(yī)學院實驗動物中心。實驗動物隨機分為對照組(24只)和實驗組(48只)。

1.2.2 動物模型的制備及標本采集 將豬心肌肌凝蛋白(蛋白濃度1 mg/ml)與等體積完全弗氏佐劑混合。于實驗第1、7、30天對實驗組小鼠進行豬心肌肌凝蛋白400 μl(含蛋白質(zhì)200 μl)注射，同時給予對照組同體積不含豬肌凝蛋白的完全弗氏佐劑及生理鹽水。于實驗第14、21、30、45天分批處死小鼠，血液離心后收集血清進行ELISA檢測抗體滴度，無菌取脾臟進行淋巴細胞增殖實驗，心肌一部分用甲醛固定，進行病理組織檢測，另一部分凍存于－80℃冰箱中，之后進行實時熒光定量PCR。

1.2.3 病理組織檢測 甲醛固定的心肌常規(guī)脫水、包埋并切片。部分切片行HE常規(guī)染色，光鏡下觀察心肌組織的炎癥改變，另一部分按免疫組化試劑盒操作步驟進行免疫組織化學染色。所需圖片均采用Leica相機及相應套件拍照攝取。

1.2.4 ELISA法檢測血清抗心肌肌凝蛋白抗體用10 μg/ml豬心肌肌凝蛋白包被96孔板，4℃過夜，用含2%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液封閉未結(jié)合位點，小鼠血清1∶50起系列倍比稀釋，室溫孵育1 h，同時設空白孔。二抗為堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠IgG，室溫下孵育1 h，加入底物p-NPP，30 min后加入1 mol/L NaOH終止反應，在酶標儀405 nm處讀取OD值。

1.2.5 脾臟淋巴細胞增殖實驗 處死小鼠后，無菌取脾臟，已以200目銅網(wǎng)研磨脾臟獲得單細胞懸浮液。用小鼠淋巴細胞分離液分離獲得淋巴細胞，PBS沖洗2遍。將獲得的淋巴細胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI1640中，將細胞濃度調(diào)至3×105個/ml。將細胞液加入96孔板中，每孔100 μl。分別加入ConA(終濃度5 μg/ml)、豬心肌肌凝蛋白(終濃度50 μg/ml)或無任何抗原，每個指標設三個復孔。于37℃、5%CO2培養(yǎng)68 h，用cck-8法檢測各孔的OD值。

1.2.6 Real-time PCR檢測心肌中B7-H4的表達情況 將凍存于－80℃冰箱中心肌在液氮中粉碎，按TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，用紫外線分光光度計測定所提取RNA的濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒配置反轉(zhuǎn)錄反應體系，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。以βactin為內(nèi)參，對cDNA中的B7-H4進行擴增。引物序列:β-actin上游引物:5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'，下游引物:5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3';B7-H4上游引物:5'-GATGACGATGCCGTTGAGTTTG-3'，下游引物:5'-GATGACGATGCCGTTGAGTTTG-3'。PCR擴增條件為95℃預變性10 min，95℃ 30 s，60℃ 1 min，共 40 個循環(huán)。采用相對定量法，檢測各組上述基因的 mRNA表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件，數(shù)據(jù)均以χ2表示，多組均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠心肌HE染色 小鼠心肌HE染色結(jié)果如圖1所示。初次免疫后14 d，小鼠心臟即出現(xiàn)炎癥表現(xiàn)，表現(xiàn)為心肌細胞間出現(xiàn)炎細胞浸潤，尤其是小血管周圍。初次免疫后第21天，心肌炎癥加重，心肌組織及間質(zhì)組織出現(xiàn)顯著的炎細胞浸潤并伴有局灶性壞死區(qū)。初次免疫后第30天，心肌炎癥仍可見明顯炎細胞浸潤，但是較第21天時已減輕。初次免疫后第45天，仍可見心肌炎癥表現(xiàn)，但是炎癥程度已大為減輕。

2.2 小鼠心肌組織免疫組織化學染色 小鼠心肌組織免疫組織化學染色結(jié)果如圖2所示。小鼠心肌免疫組化染色陽性表現(xiàn)為細胞核或者細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒。實驗結(jié)果顯示，在各個時間點心肌炎小鼠心臟均有B7-H4陽性染色出現(xiàn)，染色部位為心肌血管內(nèi)皮細胞，在周圍心肌組織及正常心肌血管則無陽性表現(xiàn)。且各個時間點的陽性染色強度無明顯差異。

2.3 心肌肌凝蛋白自身抗體檢測 心肌肌凝蛋白自身抗體檢測結(jié)果如圖3所示。對照組小鼠血清中的心肌肌凝蛋白抗體滴度在不同時間點無明顯差異(P＞0.05)。實驗組小鼠血清中的心肌肌凝蛋白自身抗體滴度在第21及30天時抗體滴度最高，第45天時已顯著降低，但較對照組均升高，差異有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。

2.4 脾臟淋巴細胞增殖實驗 脾臟淋巴細胞增殖實驗結(jié)果如圖4所示。不同時間點，在非特異性絲裂原ConA刺激下，各組小鼠的脾淋巴細胞均呈現(xiàn)出高水平增殖反應，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。在培養(yǎng)基RPMI1640刺激下，各組小鼠的脾淋巴細胞均無明顯增殖，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。在豬心肌肌凝蛋白刺激下，對照組小鼠的脾淋巴細胞無增殖反應，而實驗組小鼠的脾淋巴細胞的增殖反應隨時間變化，其中在第21天時反應水平最高，之后逐漸降低，且各組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.5 Real-time PCR檢測 Real-time PCR檢測結(jié)果如圖5所示。B7-H4 mRNA的表達情況與心肌炎癥程度、自身抗體滴度檢測結(jié)果及淋巴細胞增殖實驗結(jié)果相似。B7-H4 mRNA的相對表達量在第21及30天時最高，之后逐漸降低，但較正常組織均增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1 對照組與實驗組小鼠心肌組織HE染色(×200)Fig.1 Hematoxylin-eosin staining of heart in control group and experimental group(×200)

圖2 對照組與實驗組小鼠心肌組織免疫組織化學染色(×400)Fig.2 Immunohistochemical staining of heart in control group and experimental group(×400)

圖4 各組小鼠淋巴細胞增殖實驗結(jié)果Fig.4 Results of lymphocyte proliferation experiment in each group

圖3 對照組與實驗組小鼠血清抗心肌肌凝蛋白自身抗體滴度測定Fig.3 Serum titre determination of cardiac myosin autoantibody in controlgroup and experimental group

圖5 各組小鼠心肌Real-time PCR結(jié)果Fig.5 Results of Real-time PCR in each group

3 討論

病毒性心肌炎(VMC)是心血管系統(tǒng)常見疾病，其臨床表現(xiàn)多種多樣，既可完全沒有癥狀，又可以導致猝死，部分患者可發(fā)生擴張性心肌病(DCM)，最終誘發(fā)心力衰竭，只能通過心臟移植的方式來緩解病情。目前VMC發(fā)生發(fā)展的確切機制尚未完全闡明，因此，無法在臨床上及早發(fā)現(xiàn)并逆轉(zhuǎn)病情的發(fā)展。目前普遍認為VMC的發(fā)病機制與病毒感染后病毒的直接損傷作用和心肌損傷后引起的自身免疫反應有關(guān)，其中可能又以自身免疫反應為主。

B7家族是重要的共刺激信號分子，既可以提供共刺激信號促進T細胞的活化，又可以提供共抑制信號限制T細胞活化。B7-H4是B7家族的新成員，在免疫反應中發(fā)揮免疫抑制作用，主要表達于活化的 T 細胞、B 細胞、樹突狀細胞、吞噬細胞等［3，7，8］。目前對B7-H4的研究主要集中于腫瘤方面，如肺癌［9］、卵巢癌［10］、腎細胞癌［10］、乳腺癌［12］、胃癌［13］等，B7-H4在這些癌癥中均高表達。B7-H4在炎癥方面的研究較少，主要集中于類風濕關(guān)節(jié)炎［5，6］、腎病［4，14，，15］、糖尿?。?6］等自身免疫性疾病。而關(guān)于B7-H4在心肌炎中的表達情況尚未有相關(guān)研究。

在本研究中，我們用豬心肌肌凝蛋白構(gòu)建了小鼠EAM模型，心肌切片HE染色結(jié)果及ELISA結(jié)果呈現(xiàn)出典型的心肌炎炎癥改變，淋巴細胞增殖實驗也呈現(xiàn)出與心肌炎癥相同變化趨勢，表明EAM模型成功建立。通過Real-time PCR的結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，實驗組小鼠心肌組織中B7-H4 mRNA的相對表達量隨心肌炎病程變化而變化，表明B7-H4參與了小鼠心肌炎的病程。通過小鼠心臟組織的免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，B7-H4蛋白主要表達于心肌炎小鼠的心肌血管內(nèi)皮細胞的細胞膜及細胞漿。但是與mRNA隨病程變化的特點不同，B7-H4蛋白在心肌炎的不同時期，染色的陽性程度并無明顯差異，提示B7-H4蛋白在患心肌炎的心肌組織中固定表達，并不隨疾病的嚴重程度或者心肌組織中B7-H4 mRNA的相對表達量變化而變化。這與俞大亮等［15］在狼瘡性腎炎腎組織中觀察到的B7-H4的表達情況一致。俞大亮等發(fā)現(xiàn)，不同病理類型狼瘡腎炎之間的B7-H4蛋白表達無差異。這種病變心肌中B7-H4蛋白與B7-H4 mRNA表達的不一致還有待進一步研究。

我們觀察到B7-H4蛋白的陽性表達僅出現(xiàn)于心肌炎小鼠，在正常小鼠的心臟中并無表達。結(jié)合以往的研究我們推斷有以下兩種可能的機制導致這種現(xiàn)象的出現(xiàn):①B7-H4蛋白表達增高是心肌炎癥反應導致的反應性增高，從而發(fā)揮其免疫抑制作用，調(diào)節(jié)心肌炎病程。Kryczek等通過實驗發(fā)現(xiàn)，IL-10可以誘導APCs表面B7-H4蛋白的表達，而B7-H4對T細胞也有免疫下調(diào)的作用;郭國寧等［5］發(fā)現(xiàn)B7-H4在類風濕關(guān)節(jié)炎患者中的病變關(guān)節(jié)內(nèi)高表達，推斷B7-H4蛋白的表達是患者體內(nèi)免疫系統(tǒng)免疫活化后的結(jié)果，目的是抑制體內(nèi)過高的免疫反應。②B7-H4在心肌炎病程中發(fā)揮的是B7家族分子的免疫活化作用，促進T細胞增殖及細胞因子分泌的作用，直接參與心肌炎病程。Chen等［4］通過實驗證實，在多種自身免疫性腎病中，B7-H4蛋白均呈高表達，而在正常腎組織中并無表達，并且他們還發(fā)現(xiàn)B7-H4可以作為刺激因素活化共培養(yǎng)的T細胞，因此推斷B7-H4如同其他B7家族成員一樣，在公認的抑制免疫功能的作用之外，還具有促進T細胞增殖及細胞因子分泌的作用。但是，在心肌炎發(fā)病過程中具體是何種機制導致B7-H4蛋白表達增高還不明確，尚需要進一步研究加以確定。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明B7-H4參與到了小鼠心肌炎的病理過程之中。心肌組織中B7-H4 mRNA的相對表達量隨心肌炎病程的變化而變化。而B7-H4蛋白在心肌炎心肌中固定表達，并不隨病情的變化而改變，而且B7-H4蛋白在心肌炎的小鼠中為高表達，在正常組織不表達。這為心肌炎的臨床治療提供了一種新的可能的治療途徑。

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