郭心磊，孫芳玲，艾厚喜，張麗，王文，安宜

缺血性腦卒中是一種導致嚴重永久性殘疾的神經(jīng)損傷，其治療是當今醫(yī)學最重大的挑戰(zhàn)之一。傳統(tǒng)的研究思路是促進中樞神經(jīng)細胞的軸突再生，穿過損傷位點與靶標細胞重新建立連接。但是損傷后神經(jīng)細胞恢復非常有限，成為腦卒中預后的一大障礙。近年來，國際上提出的“神經(jīng)血管單元”[1]學說受到廣泛的關注，血管新生為神經(jīng)前體細胞增殖和分化提供了適宜的微環(huán)境。并且腦室管膜下區(qū)神經(jīng)前體細胞能夠在血管新生過程分泌的趨化因子導向下向著損傷區(qū)域遷移，且遷移后的神經(jīng)前體細胞沿著新生的血管分布。

Ephrins是酪氨酸激酶超家族受體Ephs的配體，在多種生理過程中具有廣泛的作用。其中EphrinB2表達于動、靜脈和毛細血管的內(nèi)皮細胞和神經(jīng)細胞中，在神經(jīng)、血管發(fā)育過程中具有重要作用[2-4]。敲除EphrinB2會造成胚胎小鼠心血管系統(tǒng)的嚴重畸形而導致死亡[5]。有實驗表明EphrinB2的磷酸化信號是神經(jīng)系統(tǒng)血管網(wǎng)絡正常發(fā)育的關鍵[6]。在發(fā)育中視網(wǎng)膜血管的EphrinB2被磷酸化，一旦發(fā)育完成，視網(wǎng)膜血管上EphrinB2立刻去磷酸化[7]。這提示磷酸化可能是一種活性形式。另外Ephrins在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的軸突導向、后腦分化、神經(jīng)嵴細胞遷移等過程中具有關鍵作用。在成年后，EphrinBs主要參與突觸形成及其可塑性，以及對成年神經(jīng)干細胞的增殖分化調(diào)節(jié)等作用。

最新的研究證據(jù)有，M?nsson-Broberg等通過結扎大鼠心臟的左前降支制作心肌梗死模型，向該模型中注射EphrinB2-Fc，同樣發(fā)現(xiàn)，心肌梗死半暗帶區(qū)的內(nèi)皮細胞的增殖增加，血管新生增強[8]。另外，有研究將大鼠的胸椎主動脈取出，切成0.8 mm的片段，加入EphrinB2-Fc進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)EphrinB2可促進主動脈上微血管的新生，其作用強度相當于血管內(nèi)皮生長因子的作用強度[6]。說明在一些病理條件下，該通路的活化可以促進血管的新生。在成年人胸段脊髓橫斷損傷后，病灶區(qū)EphrinB2的表達量在第1天時先下降，隨后在第14天時顯著增加[9]。

本文的創(chuàng)新點在于，首次將EphrinB2信號通路引入腦卒中的研究。研究EphrinB2信號在缺血性腦卒中后血管、神經(jīng)中的表達及其功能，對腦卒中的研究具有重要意義，符合“神經(jīng)血管單元”學說。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠24只，體重250～280 g，由北京斯貝福實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(京)20011-0004。清潔級飼養(yǎng)，預適應環(huán)境1周后進行實驗。

將大鼠編號1～24號，用隨機數(shù)表字法分為假手術組和模型組，每組12只。

1.2 主要儀器和試劑

尼龍栓線，直徑0.26 mm(2634-100)：北京沙東生物技術有限公司；美國bio-RAD Powerpac Basic電泳干轉儀：普利萊生物技術有限公司；美國Thermo Scientific輪轉式切片機：上海徠卡儀器有限公司；日本Olympus BX51顯微鏡：日本Olympus光學工業(yè)株式會社；免疫組化試劑盒SP-9000：北京中杉金橋生物技術有限公司；DAB顯色試劑盒：上海基因科技有限公司；磷酸化EphrinB2(p-EphrinB2)抗體(3481s)：美國CST；Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件。

1.3 造模

大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型的制作，造模方法參考Longa[10]方法。大鼠以10%水合氯醛350 mg/kg腹腔麻醉。切開右側頸部，逐層分離暴露右頸總動脈，結扎翼腭動脈和頸外動脈，將線栓經(jīng)頸總動脈插入約18～20 mm至大腦中動脈近端，阻斷大腦中動脈血供30 min后，拔出尼龍線。假手術組只分離動脈結扎，不插線。大鼠蘇醒后參照Longa[10]方法評分：0分，未見神經(jīng)病學征象，無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分，大鼠被提尾倒懸時，病灶右側前肢屈曲、抬高，不能伸展右側前爪；2分，行走時對側旋轉轉圈；3分，行走困難并向?qū)葍A倒；4分，不能自發(fā)行走，意識水平呈下降狀態(tài)。達到1～3分為造模成功，采用差額補充的方法補足每組的實驗動物數(shù)。

1.4 觀察指標

1.4.1 Western blotting檢測 各組大鼠分別于造模7 d后每組隨機取3只大鼠的腦皮層，新鮮取材置于液氮中，-80℃保存。加RIPA裂解緩沖液(普利萊生物技術有限公司)7倍腦皮層質(zhì)量的體積，粉碎、裂解、提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，并用裂解液調(diào)節(jié)各組蛋白濃度，加上樣緩沖液煮沸10 min，取60μg蛋白樣品在10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉搖床室溫封閉1 h，p-EphrinB2一抗(1∶1000)4℃過夜，洗膜緩沖液(TBST)5 min，洗3次，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶2000)室溫孵育1 h，進行ECL試劑化學發(fā)光法(Thermo公司)顯色，然后曝光顯影。用QuantityOne分析軟件對顯影條帶進行灰度分析，用p-EphrinB2與actin灰度值的比值表示p-EphrinB2的表達水平，實驗重復3次。

1.4.2 免疫組織化學染色 各組大鼠分別于造模7 d后隨機取6只。10%水合氯醛20 ml/kg腹腔注射麻醉，固定于手術臺，剪開胸腔，仔細剪開心包膜，暴露心臟，用9號針頭插入左心室，灌注生理鹽水，待右心耳膨起，剪開右心耳讓血液流出；至右心耳流出液無色透明時，改用4%多聚甲醛灌注固定。固定0.5 h后開顱取腦，將腦組織浸于4%多聚甲醛中。在梗死區(qū)取腦組織于50%、75%、85%、95%、100%乙醇梯度脫水；二甲苯透明；浸蠟包埋。連續(xù)冠狀切片，厚20μm。石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)中，微波修復；冷卻至室溫后，0.1 mol/L TBST洗滌3次，每次3 min；置3%H2O2去離子水孵育10 min；TBST沖洗3次，每次3 min；滴加正常山羊血清，室溫孵育60 min，傾去；分別滴加1∶50的p-EphrinB2的一抗，置于4℃孵育48 h；TBST沖洗3次，每次3 min；滴加生物素標記山羊抗兔IgG，37℃孵育60 min，TBST沖洗3次，每次3 min；滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37℃孵育60 min，TBST沖洗3次，每次3 min；滴加DAB顯色試劑，室溫顯色，顯微鏡下控制反應時間，顯色后，蒸餾水洗滌終止反應。蘇木素輕度復染，自來水水洗；1%鹽酸酒精稍分色后蘭化片刻；常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。用正常山羊血清替代一抗作陰性對照。

OlympusBX51顯微鏡觀察并攝片，采用利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分別計算p-EphrinB2陽性神經(jīng)細胞的數(shù)目。

1.5 統(tǒng)計學分析

用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用Student'st檢驗進行組間比較。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 行為學評分

模型組行為學評分1～3分，平均(2.25±0.25)分，造模成功。

2.2 Western blotting檢測p-EphrinB2表達

模型組大腦皮層的p-EphrinB2表達量高于假手術組(P<0.05)。見

圖1 Western blotting檢測兩組大腦皮層p-EphrinB2水平

2.3 免疫組化檢測p-EphrinB2表達

模型組大腦皮層血管內(nèi)皮有p-EphrinB2的表達。見圖2。模型組大腦皮層表達的p-EphrinB2陽性神經(jīng)細胞數(shù)目明顯多于假手術組(P<0.01)。見圖3、表1。

圖2 模型組皮層血管內(nèi)皮細胞中有p-EphrinB2的表達(400×)

圖3 兩組大腦皮層中EphrinB2陽性神經(jīng)細胞的表達(400×)

表1 p-EphrinB2在腦皮層中的表達量及其陽性細胞數(shù)

3 討論

腦卒中發(fā)生后神經(jīng)修復再生過程包括神經(jīng)發(fā)生、血管新生以及突觸發(fā)生和軸突再生[11]。神經(jīng)干細胞的血管微環(huán)境對神經(jīng)發(fā)生調(diào)節(jié)起至關重要的作用[12]。以往缺血性腦血管病的研究較注重神經(jīng)細胞，而對血管內(nèi)皮細胞的關注相對不夠。腦缺血后神經(jīng)和血管的相互聯(lián)系作用是現(xiàn)在腦卒中研究的熱點之一。缺血性腦卒中發(fā)生后，EphrinBs的功能是未知的。我們對EphrinBs是否恢復發(fā)育時期的功能了解得也很少。

Western blotting結果顯示，模型組大鼠大腦皮層的p-EphrinB2表達量高于假手術組。免疫組化觀察模型組大鼠大腦皮層表達p-EphrinB2的陽性神經(jīng)細胞數(shù)目也明顯增加，并且血管內(nèi)皮有p-EphrinB2的表達，說明大鼠缺血性腦卒中后EphrinB2信號通路被激活。因為EphrinB2信號通路能夠促進內(nèi)皮細胞的增殖和誘導血管側枝的芽生[8]，磷酸化EphrinB2在內(nèi)皮細胞中的出現(xiàn)，說明該通路很可能在腦卒中后損傷區(qū)域的血管新生中起作用，并且EphrinB2信號通路能夠促進神經(jīng)干細胞的增殖、遷移以及軸突的可塑性等[13-15]。所以磷酸化EphrinB2表達水平升高，提示該通路可能在缺血性腦卒中損傷后的神經(jīng)修復中起作用。因此EphrinB2通路在腦卒中后的激活可能既促進神經(jīng)恢復，也能促進血管新生，有一定的臨床意義。

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