侯曉東，劉洪柏，劉克敏

骨關(guān)節(jié)炎是一種退行性關(guān)節(jié)疾病，其基本病理改變是軟骨的退變和損傷。白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)能促進軟骨細胞的分解代謝，抑制軟骨細胞的合成修復(fù)能力，引起細胞外基質(zhì)的降解，在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生中有十分重要的作用[1-2]。

體外沖擊波(extracorporeal shock wave,ESW)治療近年來被廣泛應(yīng)用于運動醫(yī)學領(lǐng)域。由于治療時關(guān)節(jié)常常被暴露于沖擊波的治療范圍，因此其對關(guān)節(jié)軟骨的影響也引起關(guān)注。盡管現(xiàn)有的國內(nèi)外許多研究表明，低能量ESW能夠促進軟骨細胞的增殖和細胞外基質(zhì)的表達，但目前缺乏低能量ESW對骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細胞IL-1β和TNF-α表達影響的研究。本實驗應(yīng)用ESW治療實驗性兔膝骨關(guān)節(jié)炎，觀察其對關(guān)節(jié)軟骨細胞中IL-1β和TNF-α水平的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康清潔級新西蘭大白兔30只，體重2～2.5 kg，購于南方醫(yī)科大學動物實驗中心。實驗動物單籠喂養(yǎng)，飼養(yǎng)房溫度20～25℃，濕度30%～60%，自由飲食。將其隨機分成對照組、治療組和模型組，每組10只。

1.2 試劑

兔IL-1β和TNF-αELISA試劑盒：武漢博士德生物有限公司；HE染色試劑：廣東省人民醫(yī)院病理科。

1.3 方法

對照組不造模，模型組和治療組均建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型。

采用改良伸直位固定法建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型。將兔左后肢固定區(qū)域包裹棉墊，再以管型石膏固定(長度從股骨上端至踝關(guān)節(jié)上1 cm)，待石膏干硬后放回兔籠，單籠喂養(yǎng)。

造模6周后拆除石膏，治療組給予ESW(放散式DolorClast型，瑞士)治療1次，能流密度0.1 mJ/mm2(2.1 bar,8 Hz)，沖擊次數(shù)1000次。模型組和對照組均不干預(yù)。

分別于治療后4周采用空氣栓塞法處死兔子，打開兔患膝關(guān)節(jié)腔。進行大體觀察后，以銳利刀片切取股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨，10%甲醛溶液固定24 h以上，再用混合酸脫鈣液脫鈣10 d。再將標本脫水、透明、浸蠟及包埋，制成石蠟標本，經(jīng)切片機切成5μm厚的石蠟切片。分別行HE和甲苯胺藍染色，免疫組化檢測IL-1β和TNF-α的水平。

1.4 觀察指標

1.4.1 組織形態(tài)觀察 ①打開關(guān)節(jié)腔，肉眼大體觀察軟骨面情況；②HE染色觀察有關(guān)組織形態(tài)學變化；③采用軟骨組織學改變評分標準(Makin)評分：Ⅰ.表層軟骨細胞分裂增生，按正常(0分)、輕度(1分)、中度(2分)、重度(3分)計分；Ⅱ.細胞排列，按正常(0分)、稍亂但層次可分(1分)、明顯不規(guī)則層次紊亂(2分)、嚴重紊亂(3分)計分。

1.4.2 免疫組織化學染色 ①組織切片經(jīng)二甲苯Ⅰ(60℃)、二甲苯Ⅱ(60℃)脫蠟各20 min；②100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇和蒸餾水各5 min水化；③3%雙氧水室溫10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗3次；④復(fù)合消化液消化，室溫10 min，蒸餾水洗3次；⑤滴加正常山羊封閉血清，室溫20 min，甩去多余液體，不洗；⑥滴加第一抗體20 μl(抗IL-1β多克隆抗體，1∶100，羊抗兔IgG)，室溫1 h，置濕盒于4℃冰箱24 h，在室溫放置1 h，0.02 mol/L PBS液洗滌3 min，共3次；⑦滴加生物素化二抗，37℃孵育20 min，0.02 mol/L PBS液洗滌3 min，共3次；⑧滴加SABC，37℃孵育20 min，0.02 mol/L PBS液洗滌5 min，共3次；⑨將DAB顯色試劑盒內(nèi)A、B、C試劑各滴加1滴于1 ml蒸餾水內(nèi)，混勻，加至標本上，顯色5～30 min，蒸餾水洗，充分水洗；⑩蘇木素復(fù)染色，酸酒精分色，充分水洗；?60℃烤箱烤干脫水。

陽性結(jié)果：軟骨細胞包漿中出現(xiàn)棕黃色著色。著色深度與IL-1β表達強度即濃度成正比。切片經(jīng)過Olympus光學顯微鏡觀察照相，采用醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)測定計算每一個視野的陽性染色平均光密度。每個標本取6個視野(400×)，其中3個位于軟骨表層和中上層，另3個位于軟骨中下層和下層，計算每個視野的陽性細胞數(shù)和總細胞數(shù)，IL-1β、TNF-α的表達量用細胞分數(shù)表示，即陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比，最大值為100%。每張切片的細胞計數(shù)分別由兩個獨立的觀察者進行，評分誤差率控制在5%以內(nèi)，取兩者的平均值為最后的得分值。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析處理，組間兩兩比較采用t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察

①對照組：關(guān)節(jié)軟骨外觀呈藍白色，光澤明亮，無裂紋，無軟化缺損，無鈣化。②模型組：可見關(guān)節(jié)外觀明顯失去原有光澤，發(fā)黃，色澤變暗淡，軟骨觸之較軟，不透明、表面粗糙，可見明顯缺損和新生物(骨贅)，滑膜充血，存在不同程度增生、粘連，關(guān)節(jié)液量增多。③治療組：關(guān)節(jié)軟骨顏色灰白，軟骨有增生，局部有軟化和脫落，呈粗絲絨狀，并有輕度龜裂和少許新生物。

2.2 HE染色結(jié)果

①對照組：軟骨表面光滑，表層細胞呈梭形，近似水平排列，中間層細胞圓形，散在分布，柱狀層細胞排列呈柱狀。②模型組：關(guān)節(jié)軟骨變薄，軟骨細胞數(shù)目減少，細胞排列紊亂。③治療組：軟骨層變薄，細胞排列紊亂。

2.3 軟骨組織Markin評分

模型組、治療組軟骨病變評分均明顯高于對照組(P<0.01)，治療組評分明顯低于模型組(P<0.01)。見表1。

2.4 IL-1β、TNF-α表達

對照組軟骨細胞胞漿中偶見淺棕黃色IL-1β、TNF-α弱陽性染色。模型組見大量軟骨細胞呈深棕色IL-1β、TNF-α強陽性染色顆粒。治療組軟骨細胞胞漿呈淺棕黃色IL-1β、TNF-α陽性染色。模型組和治療組IL-1β和TNF-α的表達都較對照組上調(diào)(P<0.05)。治療組的表達較模型組下調(diào)(P<0.05)。見表2。

表1 軟骨組織Markin評分

注：與對照組比較，a:t=15.406,P<0.01;b:t=9.5,P<0.01；與模型組比較，c:t=4.258,P<0.01

表2 軟骨細胞IL-1β和TNF-α表達的陽性細胞率(%)

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎的病因及發(fā)病機制至今尚未完全明確，一般認為是力學和生物學因素共同作用下導(dǎo)致軟骨細胞、細胞外基質(zhì)和軟骨下骨三者降解和合成耦聯(lián)失衡的結(jié)果[1]。目前，細胞因子在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中的作用越來越受關(guān)注，其中IL-1β、TNF-α被認為是參與關(guān)節(jié)軟骨破壞的重要因子。

現(xiàn)在研究認為IL-1β是調(diào)節(jié)炎癥的始動因素。Wood等報道，在正常關(guān)節(jié)液中，只有微量的IL-1β，正常軟骨淺表層部分軟骨細胞中存在IL-1β[2]。而在骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)滑液中可檢測到高水平的IL-1β，而且IL-1β的強陽性表達可在骨關(guān)節(jié)炎軟骨的淺中層被檢測到。有研究報道，IL-1β可增強基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13、MMP-3 mRNA基因在軟骨細胞的表達，抑制Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的表達[3]。另外，在IL-1β刺激下，人與兔軟骨細胞Ⅱ型膠原酶表達均明顯下降[4]。目前，對軟骨細胞內(nèi)外基質(zhì)代謝的蛋白組學研究較多，研究中發(fā)現(xiàn)IL-1β可誘導(dǎo)Ⅱ型膠原酶及其相關(guān)分子蛋白表達下降[5]。另外IL-1β可刺激軟骨細胞產(chǎn)生大量一氧化氮(NO)，NO可引起體外培養(yǎng)的軟骨細胞發(fā)生凋亡[6]。Caramés等在人關(guān)節(jié)軟骨細胞模型上明確TNF-α與IL-1β從不同方面調(diào)控細胞凋亡[7]。有實驗發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎軟骨損害程度與caveolin-1(陷穴蛋白)的表達水平具有相關(guān)性，IL-1β可以刺激軟骨細胞表達caveolin-1，上調(diào)caveolin-1的mRNA和蛋白質(zhì)水平，誘導(dǎo)軟骨細胞的衰老，促進骨關(guān)節(jié)炎進展[8]。

TNF-α同樣是關(guān)節(jié)軟骨破壞的主要炎性因子之一[9]。TNF-α能選擇性地抑制軟骨膠原產(chǎn)生，抑制蛋白聚糖合成，同時促其降解，與骨關(guān)節(jié)炎軟骨破壞及滑膜炎有一定關(guān)系。TNF-α和IL-1β只有3%的同源性，生物活性只有IL-1β的1/100，但TNF-α于靶組織的效應(yīng)與IL-1β在很大程度上類似[10]。IL-1β和TNF-α均可作用于軟骨細胞及成纖維細胞，抑制基質(zhì)大分子如Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成，同時還可刺激軟骨降解酶(包括中性蛋白酶及膠原酶)，以及介導(dǎo)前列腺素(PGE2)的合成及分泌，從而導(dǎo)致軟骨破壞、骨吸收[8]。有研究顯示，骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中TNF-α能誘導(dǎo)其他細胞因子，包括IL-1β、單核粒細胞刺激因子的產(chǎn)生，而IL-1β能提高TNF-α的活性。因此，TNF-α與IL-1β有著協(xié)同作用，能介導(dǎo)對關(guān)節(jié)組織的破壞[11]。但TNF-α單獨使用時，其效應(yīng)力遠低于IL-1β[12-14]。

本實驗造模后6周時見軟骨表面碎裂、剝脫，滑膜增生、粘連，軟骨細胞簇集和壞死，說明軟骨已有明顯的組織形態(tài)學改變，并已處于骨關(guān)節(jié)炎中期和晚期之間，證實這一方法確能導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的形成。本實驗檢測到模型組和治療組IL-1β、TNF-α水平較對照組明顯升高，說明IL-1β和TNF-α隨著骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生而大量產(chǎn)生，并引發(fā)一系列破壞性反應(yīng)，進而促進軟骨的退變。同時研究中進一步觀察到治療組中軟骨細胞IL-1β、TNF-α的表達較模型組明顯下調(diào)，說明ESW對IL-1β、TNF-α的分泌具有明顯抑制作用。

由于臨床骨關(guān)節(jié)病患者多見于中后期，因此本研究選擇在造摸后6周開始ESW治療。趙喆等通過體外觀察ESW對軟骨細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)1.5×105Pa、900次ESW干預(yù)后，軟骨細胞增殖活性達最高，隨壓強、次數(shù)升高，軟骨細胞增殖活性明顯下降[15]。Renz等發(fā)現(xiàn)，低能量ESW對軟骨細胞的膜通透性和DNA碎片情況無顯著影響，認為低能量ESW對軟骨細胞無副作用[16]。因此本實驗采用ESW能流密度0.1 mJ/mm2、沖擊次數(shù)1000次，通過在體動物實驗對骨關(guān)節(jié)炎中后期病變治療效果的部分機制探討。本實驗結(jié)果說明，ESW治療具有抗炎作用，對受損關(guān)節(jié)軟骨具有一定的保護作用。

由于各研究過程中選擇方法差異性，目前ESW治療如何選擇合適的時間、頻率和劑量還沒有一致的認識。因此ESW作用于關(guān)節(jié)軟骨的不同部位、不同損傷階段、不同損傷程度等多種因素下最為有效的治療強度劑量組合方案以及作用機理問題還沒有明晰，需要進一步的研究。

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