禹 莉 凌云志 肖 霄 韓昂軒 彭 柯 徐鵬琛 高乾乾

(蚌埠醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系輸血學(xué)教研室 臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，蚌埠 233030)

白血病是一種造血系統(tǒng)的惡性克隆性疾病，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特性，也是導(dǎo)致治療失敗和患者死亡的主要原因?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要作用，逐漸成為惡性腫瘤治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。在基因治療方面，反義寡核苷酸和干擾技術(shù)用來(lái)干擾MMP基因表達(dá)，作為新的分子靶點(diǎn)，為腫瘤的基因治療提供新的、有前途的手段。RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA(dsRNA)所引起的序列特異性基因沉默。RNA干擾效應(yīng)具有兩個(gè)明顯的特征:特異性和高效性。與其他方法相比，RNAi技術(shù)在基因功能研究上有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)［1-3］:簡(jiǎn)單易行，容易開(kāi)展;與基因敲除相比實(shí)驗(yàn)周期短，成本低;與反義技術(shù)相比，具有高度特異性和高效性。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成針對(duì)MMP-9基因的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，并轉(zhuǎn)染人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株THP-1細(xì)胞，分析siRNA轉(zhuǎn)染后THP-1細(xì)胞中MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)的變化及其對(duì)THP-1細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料細(xì)胞株 THP-1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。主要試劑:RPMI1640培養(yǎng)液、新生牛血清為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000為 Invitrogen公司產(chǎn)品;RT-PCR試劑盒(MBI Fermentas公司);Trizol試劑(Invitrogen公司);羊抗MMP-9抗體(Santa Cruz公司);細(xì)胞裂解液、PMSF、TEMED、電泳液、封閉液、轉(zhuǎn)膜液(碧云天公司)，化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)液(Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1 目的siRNA的設(shè)計(jì)合成 參考文獻(xiàn)［4］，根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，從基因編碼區(qū)選擇靶序列1 324～1 344核苷處，委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成 siRNA，如下:5'-UUC AGG GCG AGG ACC AUA GAG-3'。并選取無(wú)意義序列作為陰性對(duì)照(siRNAN):5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA AdTdT-3'。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) THP-1細(xì)胞接種于含10% 滅活新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置37℃飽和濕度的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d細(xì)胞換液傳代培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 分為3組:空白對(duì)照組(不轉(zhuǎn)染siRNA，只應(yīng)用Lipofectamine 2000)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無(wú)意義序列)和siRNA組(轉(zhuǎn)染 MMP-9 siRNA)。轉(zhuǎn)染時(shí)以50 nmol/L的濃度用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按說(shuō)明書(shū)操作分別轉(zhuǎn)染接種細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行檢測(cè)分析，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)MMP-9 mRNA表達(dá) 參照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取不同處理組細(xì)胞總RNA。取3 μl總RNA為模板，用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此cDNA 2 μl為模板，PCR擴(kuò)增，所用引物見(jiàn)表1，引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系終體積為50 μl，反應(yīng)條件:94℃5 min，94℃ 變性1 min，60℃ 退火30 s，72℃ 延伸1 min，35個(gè)循環(huán)后72℃ 平衡10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Smart view圖像分析處理系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描分析。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)MMP-9蛋白表達(dá) 收集3組THP-1細(xì)胞，用預(yù)冷的裂解液裂解，按說(shuō)明書(shū)操作提取蛋白，Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。SDS-PAGE(8%分離膠，5% 濃縮膠)電泳后，蛋白質(zhì)濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上;封閉液封閉，分別加入稀釋的一抗37℃孵育2 h;TBST洗膜后，加入相應(yīng)的辣根酶標(biāo)記的二抗37℃孵育1 h，TBST洗膜。化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)液與膜充分接觸，曝光，凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.2.6 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)THP-1細(xì)胞的增殖能力 將3組細(xì)胞接種于96孔板(調(diào)整細(xì)胞濃度為 5 ×104ml－1)，每孔200 μl，培養(yǎng)48 h;加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;吸去上清后每孔加入200 μl DMSO，避光振蕩10 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀上讀取A570 nm值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次做5個(gè)平行孔，按照公式計(jì)算生長(zhǎng)抑制率，抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%。

1.2.7 細(xì)胞活率和形態(tài)觀察 調(diào)整3組細(xì)胞濃度為2 ×105ml－1，每瓶含5 ml培養(yǎng)液，培養(yǎng) 48、72 h，計(jì)數(shù)各組細(xì)胞數(shù)，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞活率=活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。每次每瓶計(jì)數(shù)3次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。取各組細(xì)胞先在倒置顯微鏡下觀察，再將細(xì)胞懸液離心涂片，用Wright染色，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染后THP-1細(xì)胞中MMP-9 mRNA的表達(dá) 3組細(xì)胞均可見(jiàn)MMP-9基因電泳帶存在，但其亮度存在差異，siRNA轉(zhuǎn)染組mRNA經(jīng)RT-PCR后電泳帶亮度明顯弱于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(圖1)。電泳圖譜經(jīng)圖像軟件分析，siRNA組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組MMP-9 mRNA的表達(dá)強(qiáng)度結(jié)果見(jiàn)表 2，顯示轉(zhuǎn)染 MMP-9 siRNA后，siRNA組MMP-9 mRNA的表達(dá)與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。

表1 擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參照引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度Tab.1 Primer sequences and length of productions of objective genes and β-actin

2.2 siRNA轉(zhuǎn)染后THP-1細(xì)胞中MMP-9蛋白的表達(dá) Western blot對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2，siRNA轉(zhuǎn)染組條帶亮度明顯弱于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。經(jīng)圖像軟件分析，結(jié)果顯示:siRNA組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的內(nèi)參β-actin蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異，而siRNA組MMP-9蛋白的表達(dá)與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較均有顯著性差異(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 MMP-9 siRNA對(duì)THP-1細(xì)胞增殖能力的影響

siRNA組轉(zhuǎn)染后48、72 h，THP-1細(xì)胞的增殖能力與對(duì)照組相比較，A570 nm值明顯下降(P＜0.05)，細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)，生長(zhǎng)抑制率增加。表明MMP-9 siRNA具有抑制THP-1細(xì)胞增殖的能力(表3)。

2.4 MMP-9 siRNA對(duì)THP-1細(xì)胞活率的影響siRNA組轉(zhuǎn)染后48、72 h，THP-1細(xì)胞活率為與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比較明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)，結(jié)果見(jiàn)表4，表明MMP-9 siRNA能夠抑制THP-1細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖1 RT-PCR檢測(cè)MMP-9 mRNA的表達(dá)Fig.1 Express of MMP-9 mRNA by RT-PCR

圖2 Western blot檢測(cè)MMP-9蛋白的表達(dá)Fig.2 Express of MMP-9 protein by Western blot

2.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下可見(jiàn)空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞呈半貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞輪廓清楚，形態(tài)均一，生長(zhǎng)旺盛。而siRNA組細(xì)胞生長(zhǎng)受抑，細(xì)胞集落減少，大小不一，胞膜明顯皺縮，細(xì)胞中顆粒增多，細(xì)胞碎片增多，見(jiàn)圖3。經(jīng)Wright染色后觀察，對(duì)照組THP-1細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞膜完整，染色質(zhì)疏松，呈紫紅色，核仁清晰，胞漿量少;siRNA組細(xì)胞形態(tài)有明顯改變，大小不一，細(xì)胞著色不均，大部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、體積縮小，細(xì)胞核固縮，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮凝聚，出現(xiàn)核邊聚、核碎裂、核溶解，并可見(jiàn)典型的凋亡小體等，見(jiàn)圖 4、5。

表2 各組MMP-9 mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)水平(，n=3)Tab.2 Express value of MMP-9 mRNA and protein(，n=3)

表2 各組MMP-9 mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)水平(，n=3)Tab.2 Express value of MMP-9 mRNA and protein(，n=3)

Note:1)P＜0.05 vs blank control group;2)P＜0.05 vs negative control group.

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表3 MMP-9 siRNA對(duì)THP-1細(xì)胞增殖能力的影響(，n=3)Tab.3 Effect of MMP-9 siRNA on proliferation of THP-1 cells(，n=3)

表3 MMP-9 siRNA對(duì)THP-1細(xì)胞增殖能力的影響(，n=3)Tab.3 Effect of MMP-9 siRNA on proliferation of THP-1 cells(，n=3)

Note:1)P＜0.01 vs blank control group;2)P＜0.05 vs negative control group.

Group 48 h A570 nm value rate of inhibition(%)72 h A570 nm value rate of inhibition(%)Blank control group 0.446 1±0.073 0 0.461 6±0.31 0546 0 Negative control group0.410 8±0.084 4 7.9 0.437 7±0.084 1 5.2 siRNA group 0.350 5±0.061 21)2)21.4 0.318 7±0.062 31)2)

表4 MMP-9 siRNA對(duì)THP-1細(xì)胞活率的影響(，n=3)Tab.4 Effect of MMP-9 siRNA on motility rate of THP-1 cells(，n=3)

表4 MMP-9 siRNA對(duì)THP-1細(xì)胞活率的影響(，n=3)Tab.4 Effect of MMP-9 siRNA on motility rate of THP-1 cells(，n=3)

Note:1)P＜0.01 vs blank control group;2)P＜0.05 vs negative control group;3)P＜0.01 vs negative control group.

Group The motility rate of THP-1 cells(%)48 h 72 h Blank control group 86.89±5.95 85.33±5.66 Negative control group 82.33±3.87 80.11±4.57 siRNA group 73.44±6.481)3) 74.11±6.011)2)

圖3 倒置顯微鏡下THP-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變(×400)Fig.3 Changes in morphology of THP-1 cells through inverted microscope( ×400)

圖4 Wright染色后THP-1細(xì)胞形態(tài)(×100)Fig.4 Morphology of THP-1 cells after Wright stain( ×100)

圖5 Wright染色后THP-1細(xì)胞形態(tài)(×400)Fig.5 Morphology of THP-1 cells after Wright stain( ×400)

3 討論

白血病是一種常見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國(guó)，兒童及35歲以下成人惡性腫瘤的死亡率中，其中由白血病引起的居首位，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。惡性腫瘤的主要特點(diǎn)是侵襲并向遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，在惡性腫瘤突破細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)入血管，以及新生血管的出芽過(guò)程中都需要降解細(xì)胞外基質(zhì)。腫瘤細(xì)胞對(duì)基底膜膠原的溶解是其向細(xì)胞外基質(zhì)擴(kuò)散的起始，因此基底膜完整性的破壞被認(rèn)為是惡性腫瘤侵襲開(kāi)始的一個(gè)標(biāo)志。MMP-9是鋅離子依賴(lài)性蛋白水解酶超家族成員之一，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，它屬于Ⅳ型膠原酶，主要降解細(xì)胞外基質(zhì)中基底膜的主要結(jié)構(gòu)蛋白-Ⅳ型膠原，并能促進(jìn)血管生成和調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附性，促進(jìn)細(xì)胞的遷移［5-7］，因此，它在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中占有重要的地位。

目前急性白血病的主要治療手段是通過(guò)細(xì)胞毒藥物殺滅病人體內(nèi)惡性增殖的白血病細(xì)胞，這雖然能使大部分患者獲得緩解和延長(zhǎng)生存期，但治愈率低，而且由于化療藥物的非特異性細(xì)胞毒性，往往造成患者治療的相關(guān)性死亡。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)與基因工程的研究進(jìn)展，白血病的基因治療已被廣泛研究，部分白血病基因治療進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，基因治療不但為白血病開(kāi)辟出新的治療途徑，而且有可能成為治愈白血病的重要手段。RNAi已成為分子生物學(xué)研究的主要技術(shù)手段之一，其作用機(jī)制是通過(guò)活化的siRNA靶向降解目的mRNA，從而使目的基因表達(dá)沉默。目前，MMP作為抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移治療靶點(diǎn)的研究已開(kāi)展。

在本實(shí)驗(yàn)中，將靶向MMP-9的特異性siRNA轉(zhuǎn)染至THP-1細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，在siRNA轉(zhuǎn)染組THP-1細(xì)胞MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)明顯受到抑制，顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

MTT結(jié)果顯示，siRNA組轉(zhuǎn)染后48、72 h，THP-1細(xì)胞的增殖能力與對(duì)照組相比較，A570 nm值明顯下降(P＜0.05)，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)，生長(zhǎng)抑制率增加。表明MMP-9 siRNA具有抑制THP-1細(xì)胞增殖的能力。臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示，siRNA組轉(zhuǎn)染后48、72 h，THP-1細(xì)胞活率與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比較明顯下降，表明MMP-9 siRNA能夠抑制THP-1細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞呈半貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞輪廓清楚，形態(tài)均一，生長(zhǎng)旺盛。而siRNA組細(xì)胞生長(zhǎng)受抑，細(xì)胞集落減少，大小不一，胞膜明顯皺縮，細(xì)胞中顆粒增多，細(xì)胞碎片增多，經(jīng)Wright染色后觀察，對(duì)照組THP-1細(xì)胞呈圓形，染色質(zhì)呈紫紅色，胞漿量少;siRNA組細(xì)胞形態(tài)有明顯改變，大部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、體積縮小，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)核固縮、核邊聚、核碎裂，并可見(jiàn)典型的凋亡小體等。研究表明MMP-9 siRNA能夠促進(jìn)THP-1細(xì)胞凋亡?？傊芯拷Y(jié)果提示:采用siRNA技術(shù)可靶向干擾體外THP-1白血病細(xì)胞MMP-9 mRNA和蛋白水平的表達(dá)，在MMP-9表達(dá)受抑后可有效抑制THP-1細(xì)胞的增殖，促進(jìn)THP-1細(xì)胞凋亡。這就為包括白血病在內(nèi)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤的基因治療提供了一個(gè)新的切入點(diǎn)。

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