何躍平 羅晶晶 劉 釗 安 立 李祥東 張 艷

(遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬珠海醫(yī)院耳鼻喉科，珠海 519100)

livin是近年來發(fā)現(xiàn)的人類凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis protein，IAP)新成員，在大多數(shù)正常成人組織不表達(dá)，而在多種腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)高表達(dá)［1，2］，與腫瘤抗凋亡效應(yīng)明顯相關(guān)。livin 基因有l(wèi)ivin-α和livin-β兩個(gè)異構(gòu)體，分別編碼長度為298和280個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，它們的功能略有不同［3］。本實(shí)驗(yàn)利用siRNA技術(shù)沉默livin基因的表達(dá)，觀察 livin表達(dá)下調(diào)對(duì)鼻咽細(xì)胞系 CNE-2Z caspase-3的活性、增殖和凋亡的影響，為鼻咽癌基因治療提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2Z由本室保存;RT-PCR試劑盒購自北京博大泰克;質(zhì)粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒購自Axygen公司;caspase-3活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;鼠抗人livin單克隆抗體購自Abcam公司;LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司;小牛血清購自杭州四季青。

1.2 livin siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 livin siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建見參考文獻(xiàn)［4］?；趌ivin-β僅比livin-α連續(xù)少54個(gè)堿基，即 livin-α包含了 livin-β的全部堿基序列，針對(duì) livin-β(GenBank NM_022161)，即 livin-α 和 livin-β 的共有區(qū)設(shè)計(jì)靶向livin的siRNA序列。

1.3 CNE-2Z細(xì)胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染 鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)傳代，收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以2.0×105ml－1接種于 24孔板，過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞長至90%孔底面積時(shí)分別以實(shí)驗(yàn)組重組質(zhì)粒(pGPU6/GFP/Neo-livin)、陰性對(duì)照質(zhì)粒(pGPU6/GFP/Neo-shNC，無關(guān)序列對(duì)照組)轉(zhuǎn)染 CNE-2Z細(xì)胞，具體操作按LipofectamineTM2000試劑盒說明書進(jìn)行，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的CNE-2Z細(xì)胞為空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后24 h于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果，分別于轉(zhuǎn)染后0～72 h收集細(xì)胞檢測相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。

1.4 RT-PCR檢測livin沉默后mRNA表達(dá)情況將各組細(xì)胞濃度調(diào)至6.0×105ml－1接種于6孔板，分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72 h提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)GeneBank提供的livin、β-actin mRNA序列設(shè)計(jì)引物(表1)。紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度，保證反轉(zhuǎn)錄體系中每組所加RNA的量相同。以β-actin作為內(nèi)參照檢測基因表達(dá)水平，RT-PCR產(chǎn)物以2.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察目的片段，利用AlphaImager 2200軟件進(jìn)行灰度分析并計(jì)算livin mRNA表達(dá)抑制率。

1.5 Western blot檢測livin沉默后蛋白表達(dá)情況常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白，取60 μg蛋白上樣到12%SDS-PAGE凝膠，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，分別用抗livin抗體(1∶1 000)和抗 β-actin 抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃孵育1 h。TBST洗膜后在暗室X片曝光1 min左右，顯影、定影后成像拍照。

1.6 caspase-3活性檢測 將CNE-2Z細(xì)胞總濃度調(diào)整成1.0 ×105ml－1接種于24 孔板，每孔500 μl培養(yǎng)24 h后進(jìn)行同步化處理，分別于轉(zhuǎn)染后0、12、24、48 h后收集細(xì)胞，依照caspase-3活性檢測試劑盒說明書提取蛋白，以酶標(biāo)儀測定色敏底物DEVD-pNA被蛋白酶分解后的pNA在405 nm波長處的吸光度值。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度Tab.1 Sequence of PCR primers and lengths of amplification products

1.7 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性 將CNE-2Z細(xì)胞濃度調(diào)整成1.0×104ml－1，接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加200 μl培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后進(jìn)行同步化處理，分別于轉(zhuǎn)染后12、24、48、72 h每孔加入 5 mg/ml的 MTT(20 μl/孔)，37℃ 孵育 4 h 后棄上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩裂解10 min待藍(lán)色結(jié)晶溶解后，酶標(biāo)儀測定570 nm波長處吸光度(A)值。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 收集轉(zhuǎn)染后48 h的各組CNE-2Z細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min后棄上清，用4℃預(yù)冷的70%乙醇固定。4℃固定18 h后調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106ml－1，取1 ml細(xì)胞懸液，PBS洗3次，細(xì)胞重懸于1 ml PI染液中，37℃孵育30 min進(jìn)行流式分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析用SPSS18.0軟件進(jìn)行，各組間差異比較采用方差分析，組間百分率采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染率的觀察 siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE-2Z細(xì)胞24 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染率約為60%～70%(圖1)。

2.2 siRNA抑制CNE-2Z細(xì)胞中l(wèi)ivin mRNA的表達(dá) RT-PCR檢測結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組pGPU6/GFP/Neo-livin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后livin mRNA表達(dá)水平明顯受到抑制(圖2，泳道4)，與空白組相比抑制率達(dá)到64.38%，陰性對(duì)照組與空白組相比，livin mRNA表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)。

圖1 基因轉(zhuǎn)染熒光顯微鏡照片圖(×100)Fig.1 Fluorescent microscope photograph of gene transfection(×100)

2.3 siRNA抑制CNE-2Z細(xì)胞livin蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組pGPU6/GFP/Neo-livin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后livin蛋白表達(dá)水平明顯受到抑制(圖3)，與空白組相比抑制率達(dá)61.43%，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比livin蛋白表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)。

圖2 pGPU6/GFP/Neo-livin質(zhì)粒對(duì)CNE-2Z細(xì)胞livin mRNA表達(dá)水平的影響Fig.2 Effect of pGPU6/GFP/Neo-livin plasmid on livin mRNA level in CNE-2Z cells

圖3 pGPU6/GFP/Neo-livin質(zhì)粒對(duì)CNE-2Z細(xì)胞livin蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of pGPU6/GFP/Neo-livin plasmid on livin protein level in CNE-2Z cells

圖4 各組細(xì)胞caspase-3的活性檢測Fig.4 Detection of caspase-3 activity in different groups

2.4 caspase-3酶活性變化 檢測結(jié)果顯示:pGPU6/GFP/Neo-livin轉(zhuǎn)染 CNE-2Z細(xì)胞后，caspase-3酶活性隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長逐漸增高，轉(zhuǎn)染后48 h達(dá)到最高(圖4)，pNA含量為6.68 nmol/L，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組則不能有效地激活caspase-3的活性。

2.5 細(xì)胞增殖活性的變化MTT法檢測各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后0～72 h生長情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組pGPU6/GFP/Neo-livin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后能顯

圖5 pGPU6/GFP/Neo-livin質(zhì)粒對(duì)CNE-2Z細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effect of pGPU6/GFP/Neo-livin plasmid on cell proliferation of CNE-2Z cells

表2 各組細(xì)胞凋亡率(%)Tab.2 Apoptosis rate of CNE-2Z cells in each group(%)

圖6 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡水平代表圖Fig.6 Representative diagrams of cell apoptosis detected by flow cytometry

著抑制CNE-2Z細(xì)胞的增殖，并呈時(shí)間依賴性，抑制率最高達(dá)38.7%(P＜0.01)，而空白組和陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖活性未見改變(圖5)。

2.6 轉(zhuǎn)染后CNE-2Z細(xì)胞凋亡率的變化 轉(zhuǎn)染后48 h，livin特異性siRNA組細(xì)胞的凋亡率顯著增加，與空白組和陰性對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.01)，說明沉默livin的表達(dá)可增加細(xì)胞的凋亡(表2、圖6)。

3 討論

惡性腫瘤細(xì)胞凋亡失衡與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和患者預(yù)后有著密切關(guān)系［5］。抑制IAPs家族成員蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，是目前腫瘤靶向治療的一個(gè)新的研究方向［6］。livin是近年發(fā)現(xiàn)的人類IAP家族的新成員，與腫瘤有較強(qiáng)的相關(guān)性，可在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常分化成熟組織中基本不表達(dá)［7］。RNA干擾(RNAi)是近年發(fā)展起來的一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默技術(shù)，它是由生物體細(xì)胞內(nèi)外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA所引起的序列特異性基因沉默現(xiàn)象。與反義寡核苷酸技術(shù)、基因敲除技術(shù)及抗體介導(dǎo)的基因表達(dá)沉默技術(shù)相比，RNAi具有特異性強(qiáng)、抑制效率高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于功能基因組學(xué)以及疾病的基因治療等方面［8］。本實(shí)驗(yàn)利用RNAi技術(shù)成功地抑制了CNE-2Z細(xì)胞中l(wèi)ivin mRNA和蛋白的表達(dá)，抑制率分別為64.38%、61.43%，說明所選擇的siRNA序列具有良好的干擾效率。

與其他IAP家族成員相似，livin包含1個(gè)串聯(lián)的含有半胱氨酸/組氨酸的桿狀病毒IAP重復(fù)區(qū)(Baculovirus IAP repeat，BIR)的結(jié)構(gòu)，相鄰的羧基末端含有一個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)。livin的抗凋亡活性就主要依賴于其BIR的結(jié)構(gòu)域。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)livin和其下游的caspase-3、caspase-7的相互作用是也依賴于BIR結(jié)構(gòu)域［3］。livin抑制細(xì)胞凋亡主要是通過直接抑制凋亡蛋白酶(caspases)而實(shí)現(xiàn)的，Vucic等［9］發(fā)現(xiàn)livin可與 caspase-3、caspase-9及 caspase-9前體發(fā)生免疫共沉淀，由此推斷 livin可以通過抑制caspase-3及caspase-9的活性而抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡，且caspase-3是caspases家族中最重要的凋亡效應(yīng)蛋白，它的激活是凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵。向燕群［10］等人使用抗癌藥拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TopoⅡ)抑制劑吡喃阿霉素(THP)、阿霉素(ADM)誘導(dǎo)鼻咽低分化鱗癌細(xì)胞株 SUNE-1細(xì)胞凋亡，藥物作用24 h后，SUNE-1細(xì)胞凋亡率增加，流式細(xì)胞儀檢測livin表達(dá)水平增高，這就說明癌細(xì)胞表達(dá)livin是一種抗凋亡的防御機(jī)制。Crnkovic＇-Mertens等人［11］利用 RNAi技術(shù)特異性沉默Hela細(xì)胞的livin基因，癌細(xì)胞凋亡率增加且對(duì)抗癌藥物和TNF-α的敏感性增加，且caspase-3，7，9的活性增加。本次實(shí)驗(yàn)研究表明livin表達(dá)下調(diào)可以有效地促進(jìn)細(xì)胞中caspase-3活性的增加，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率達(dá)到22.6%，約為空白組細(xì)胞凋亡率的6倍。MTT檢測細(xì)胞增殖活性結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長明顯受到抑制，抑制率最高達(dá)38.7%。

本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，livin靶向RNA干擾增強(qiáng)了CNE-2Z細(xì)胞caspase-3的活性，增加了鼻咽癌細(xì)胞凋亡率，抑制了鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力，提示livin基因可作為鼻咽癌治療的新靶點(diǎn)。

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