湯 巧 丁 潔(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 210006)

肥大細(xì)胞(Mast cells)在傳統(tǒng)意義上是參與速發(fā)型超敏反應(yīng)及變態(tài)反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞［1］，表面表達(dá) Fcγ 受體(FcγRs)和 Toll-樣受體(TLRs)等多種受體，與多種生理、病理反應(yīng)有關(guān)。小鼠肥大細(xì)胞可分為黏膜肥大細(xì)胞(Mucosal mast cell，MMCs)和結(jié)締組織肥大細(xì)胞(Connective tissue mast cell，CTMCs)兩個群體［2］。所有的小鼠肥大細(xì)胞均表達(dá)抑制型受體FcγRⅡB，但僅有CTMCs表達(dá)興奮型受體FcγRⅢA。

近年來，肥大細(xì)胞在獲得性免疫中的作用受到廣泛重視。目前觀點(diǎn)認(rèn)為，激活的肥大細(xì)胞除了促成炎癥微環(huán)境而作用于非特異性T細(xì)胞，也通過參與抗原遞呈作用于特異性T細(xì)胞［3，4］。小鼠骨髓源性肥大細(xì)胞(BMMC)可以通過IgE受體FcεR內(nèi)吞抗原，凋亡的肥大細(xì)胞被樹突狀細(xì)胞吞噬、處理，遞呈抗原多肽給表達(dá)特異性受體的T細(xì)胞［3］。我們推測肥大細(xì)胞也可通過FcγRs促進(jìn)對特異性抗原的結(jié)合，進(jìn)而影響特異性T細(xì)胞反應(yīng)。

CTMCs代表更成熟的肥大細(xì)胞類型，其表面平衡表達(dá)兩種FcγR。本文初步研究小鼠CTMCs通過FcγRs結(jié)合抗原、進(jìn)而影響特異性T細(xì)胞反應(yīng)的能力和機(jī)理，希望進(jìn)一步闡明CTMCs在獲得性免疫中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6小鼠購自Taconic Farms(Ry，Denmark)6～8周齡，OT-II.2a/Rag1(OT-II)mice(6～8周齡)來自 MIVAC breeding unit，University of Gothenburg。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Sigma-Aldrich，Steinheim，Germany)，小鼠干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF，PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA)，重組小鼠白細(xì)胞介素4(Interleukin-4，Immunotools)，7-amino-actinomycinD(7-AAD;Sigma-Aldrich)，PE-標(biāo)記的抗小鼠 cKit(Clone 2B8;eBioscience)，Alexa Fluor 647-標(biāo)記的倉鼠抗小鼠 FcεRI alpha(Clone MAR-1;eBioscience，San Diego，CA，USA)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠 FcγRⅢA(Clone 275003;mouse IgG2a，R＆D Systems，Minneapolis，USA)，雞卵清蛋白(Ovalbumin，OVA，Sigma-Aldrich)，AlexaFluor 488-conjugated OVA(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA) ，小鼠抗 OVA IgG1(Sigma-Aldrich)，PE標(biāo)記的抗小鼠 CD69(Clone H1.2F3，eBioscience)，PE-cy7標(biāo)記的抗小鼠 CD4(Clone GK1.5，eBioscience)，F(xiàn)ITC mouse anti/human Ki-67 set(BD Pharmingen)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和分化檢測

1.3.1 小鼠CTMCs的培養(yǎng) 取C57BL/6小鼠的股骨，用1 ml注射器抽取培養(yǎng)基將股骨腔內(nèi)的骨髓細(xì)胞沖出，裂解紅細(xì)胞，直接調(diào)整細(xì)胞濃度(1×106ml－1)加入到含10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從骨髓細(xì)胞分化CTMCs。培養(yǎng)體系含青霉素 100 U/ml、鏈霉素 100 μg/ml、4 mmol/L L-谷氨酰胺、50 μmol/L 2-巰基乙醇、1 mmol/L 丙酮酸鈉。為促進(jìn)肥大細(xì)胞向CTMCs分化，50 ng/ml SCF、2 ng/ml重組小鼠IL-4作為補(bǔ)充成分加入體系。CTMCs培養(yǎng)6～8周，每周一次更換新鮮培養(yǎng)液。通過檢測cKit(CD117)、FcεRⅠ和 FcγRⅢA 表達(dá)而判斷CTMCs的分化。

1.3.2 免疫復(fù)合物形成 將雞卵清蛋白OVA或AlexaFluor 488-conjugated OVA與小鼠抗OVA IgG1(Sigma-Aldrich)在37℃混勻，培養(yǎng)20 min。

1.3.3 CTMCs與抗原抗體復(fù)合物共培養(yǎng) 在96孔培養(yǎng)板中將80 μl CTMC 與20 μl AlexaFluor 488-OVA或AlexaFluor 488-OVA/抗OVA IgG1免疫復(fù)合物混勻。OVA終濃度為130 μg/ml，IgG1終濃度為280 μg/ml。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行流式檢測。

1.3.4 CTMCs與T細(xì)胞共培養(yǎng) 在96孔圓底培養(yǎng)板中將 80 μl CTMC 與 20 μl OVA 或 OVA/抗OVA IgG1免疫復(fù)合物混勻，OVA終濃度為130 μg/ml，IgG1 終濃度為 280 μg/ml。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。充分洗滌后，將1×105結(jié)合OVA抗原的CTMC在96孔圓底培養(yǎng)板中與4×105未分選的OT-II小鼠而來的脾臟單個核細(xì)胞共培養(yǎng)，37℃孵育72 h，檢測CD4+T細(xì)胞的CD69表達(dá)。T細(xì)胞增殖用Ki-67染色。

1.3.5 流式檢測 細(xì)胞用含1%BSA的冷PBS洗滌，與相應(yīng)熒光染料4℃避光染色20 min，洗滌，檢測。Ki-67染色按試劑說明書進(jìn)行，簡述如下:收集細(xì)胞懸液，用70%冰乙醇固定2 h、洗滌后再用Ki-67熒光抗體室溫30 min避光染色，洗滌，檢測。用LSR-Ⅱ(BD Biosciences，San Jose，CA) 儀器檢測熒光強(qiáng)度并用FlowJo軟件(FlowJo，Ashland，OR)分析，根據(jù)前向散射光(FSC)和側(cè)向散射光(SSC)以及7-AAD染色，選擇活細(xì)胞設(shè)門，然后對染色細(xì)胞作相應(yīng)熒光染料的熒光強(qiáng)度檢測。

2 結(jié)果

2.1 CTMCs表面標(biāo)志的檢測 小鼠骨髓源性培養(yǎng)的肥大細(xì)胞(Bone marrow-derived cultured mast cells，BMMC)經(jīng)常被用來研究肥大細(xì)胞的生物學(xué)活性。然而，在富含IL-3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的BMMC類似 MMCs，并不表達(dá) FcγRⅢA［5］。小鼠骨髓細(xì)胞在富含SCF和IL-4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)可得到表達(dá)FcγRⅢA 的 CTMCs［6］。已知 FcεRⅠ和 cKit雙陽性細(xì)胞為肥大細(xì)胞表面標(biāo)志陽性細(xì)胞。我們選擇活細(xì)胞設(shè)門檢測其表型，發(fā)現(xiàn)95%以上的細(xì)胞表達(dá)肥大細(xì)胞特異性表面標(biāo)志cKit和FcεRⅠ(圖1A)進(jìn)一步檢測其FcγRⅢA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)熒光染色(線型曲線)后與同型對照(陰影曲線)相比較，F(xiàn)cγRⅢA峰顯著右移(圖1B)。結(jié)果表明成功誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞向CTMCs分化。

2.2 IgG促進(jìn)CTMCs對特異性抗原的結(jié)合 對外來抗原進(jìn)行遞呈或交叉遞呈的第一步是將其內(nèi)吞入細(xì)胞進(jìn)行加工處理。為了證明CTMCs可能以一種抗原依賴性方式作用于T細(xì)胞，我們檢測了CTMCs內(nèi)吞抗原的能力。OVA是一種模式蛋白，我們用流式細(xì)胞術(shù)檢測CTMCs通過FcγR對OVA-488熒光蛋白的內(nèi)吞作用。結(jié)果表明，將CTMCs與OVA-488/抗OVA-IgG免疫復(fù)合物孵育后，與僅僅加入OVA-488蛋白相比，可以觀察到明顯的 OVA攝取增加，熒光強(qiáng)度增高(圖2)。因此，IgG通過 FcγR促進(jìn)CTMCs對特異性抗原的結(jié)合。

2.3 結(jié)合了免疫復(fù)合物的CTMCs促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞的激活 本研究中所用的OT-II.2a/Rag1(OT-II)小鼠表達(dá) MHCⅡ類抗原限制性O(shè)VA多肽323-339特異性TCR，我們分離脾臟單個核混合細(xì)胞作為抗原特異性T細(xì)胞的來源，在混合細(xì)胞中還包含樹突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞。CTMCs與OVA/抗OVA-IgG免疫復(fù)合物孵育后，將CTMC充分洗滌以去除未結(jié)合的免疫復(fù)合物。通過細(xì)胞表面FcγRs結(jié)合了抗原的 CTMC與抗原特異性T細(xì)胞共同孵育3 d，以未加抗原共培養(yǎng)的CTMC作為陰性對照，抗原特異性T細(xì)胞與OVA抗原共培養(yǎng)72 h為陽性對照，可觀察到明顯的T細(xì)胞激活和增殖(圖3)。CD69是細(xì)胞表面一種磷酸化的同二聚體蛋白，是淋巴細(xì)胞早期活化標(biāo)記物，在刺激物作用下會迅速表達(dá)。Ki-67是一種與細(xì)胞分裂增殖有關(guān)的核蛋白，在有絲分裂的G1中期到晚期出現(xiàn)，M期到最高值。我們的結(jié)果表明，僅結(jié)合OVA的CTMC僅微弱刺激CD69和Ki-67的表達(dá)，而通過FcγRs結(jié)合 OVA/抗OVA免疫復(fù)合物的CTMC可較大程度刺激CD69和Ki-67的表達(dá)。

圖1 FACS檢測CTMCs表面 FcγRⅠ、cKit以及 FcγRⅢA的表達(dá)Fig.1 FACS analysis of FcγRⅠ，cKit and FcγRⅢA expression on surface of cultured CTMCs

圖2 抗原特異性IgG促進(jìn)CTMCs對抗原的內(nèi)吞Fig.2 Enhancement of antigen internalization by antigenspecific IgG in cultured CTMCs

圖3 結(jié)合抗-OVA IgG/OVA復(fù)合物的CTMCs促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖和活化Fig.3 Anti-OVA IgG/OVA complexes-incorporated CTMCs promote proliferation and activation of CD4+T cells

3 討論

黏膜免疫系統(tǒng)是執(zhí)行局部免疫防御的主要場所。肥大細(xì)胞廣泛分布于黏膜層和黏膜下層，這種分布特點(diǎn)使它成為黏膜免疫系統(tǒng)中首先與外界變應(yīng)原及病原體相互作用的“哨兵”。CTMCs主要分布在無菌的結(jié)締組織部位，而MMCs分布在非無菌的胃腸道和消化道黏膜固有層，因此，從理論而言，CTMCs在對外來抗原的反應(yīng)上更為“警覺”，故CTMCs對抗原特異性T細(xì)胞的激活作用可能具有重要的生理意義。此外，CTMCs也可通過FcγRs交聯(lián)參與抗體反饋(Antibody feedback)。肥大細(xì)胞激活劑可促進(jìn)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，被認(rèn)為可發(fā)揮黏膜佐劑的功能。有研究認(rèn)為，將肥大細(xì)胞激活劑與IgG形成復(fù)合物，通過IgG可進(jìn)一步對免疫反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控［7-9］。

本文進(jìn)一步揭示了IgG抗體的自然佐劑的作用，部分是由于IgG抗體與抗原形成復(fù)合物后，通過肥大細(xì)胞以抗原依賴的方式對細(xì)胞和體液免疫進(jìn)行調(diào)控;CTMCs在抗原特異性T細(xì)胞激活中發(fā)揮重要作用。CTMCs通過其表面的FcγRs結(jié)合抗原后，以抗原特異性的方式刺激CD4+T淋巴細(xì)胞增殖，但其機(jī)理還有待進(jìn)一步探討。

小鼠肥大細(xì)胞表達(dá)的受體有FcγRⅢA和FcγRⅡB兩種FcγRs，所有肥大細(xì)胞均表達(dá)抑制型受體FcγRⅡB，但僅有 CTMCs表達(dá) FcγRⅢA［10］。首先，CTMCs通過FcγRs攝取抗原后，可能作為抗原遞呈細(xì)胞而直接作用于T細(xì)胞。肥大細(xì)胞含有溶酶體、酸性水解酶［11］，有加工處理抗原所需的特性。Frandji［12］分析了小鼠骨髓源性培養(yǎng)的肥大細(xì)胞(BMMC)的抗原遞呈細(xì)胞(APC)功能，認(rèn)為肥大細(xì)胞遞呈外源性和內(nèi)源性抗原的能力有差別。Malaviya的研究［13］表明，肥大細(xì)胞可吞噬革蘭氏陰性桿菌并對細(xì)菌抗原進(jìn)行加工，通過MHCⅠ類分子遞呈給T雜交瘤細(xì)胞。我們的研究表明，盡管IgE的高親和力受體FcεRⅠ交聯(lián)是肥大細(xì)胞上研究最多的調(diào)控途徑，F(xiàn)cγRs交聯(lián)途徑也發(fā)揮重要作用，而IgG是表達(dá)FcγRs的CTMCs攝取特異性抗原的有效橋梁。其次，CTMCs細(xì)胞表面有2種FcγRs，F(xiàn)cγRⅡB和FcγRⅢA，對抗原抗體復(fù)合物所引起的凋亡有一定程度的抵抗作用，OVA/抗OVA-IgG復(fù)合物并不引起CTMCs細(xì)胞的凋亡［14］。有文獻(xiàn)報道，BMMC通過IgE受體FcεRI內(nèi)吞抗原并發(fā)生凋亡，凋亡后樹突狀細(xì)胞吞噬凋亡小體，從而成為一個持續(xù)的抗原庫，使T細(xì)胞激活［3］。我們在對MMCs的研究中也觀察到類似于BMMC的通過FcγRⅡB交聯(lián)而發(fā)生的上述現(xiàn)象(文章待發(fā)表)。如果CTMCs通過FcγRs結(jié)合免疫復(fù)合物后，不能通過凋亡、繼而被APC吞噬成為一種抗原儲存庫的方式激活 T細(xì)胞，那么提示著尚有其他途徑激活T細(xì)胞，在今后的研究中必須關(guān)注這個問題。第三，CTMCs的MHCⅠ類和Ⅱ類抗原、共刺激分子的表達(dá)也會影響抗原特異性T細(xì)胞的激活，但在本文的研究體系中可能并不發(fā)揮重要作用［3］。

本文研究提示，CTMCs也可能參與抗體反饋的調(diào)控過程，通過 IgG/FcγRs交聯(lián)對抗原特異性CD4+T細(xì)胞、繼而對B細(xì)胞活性產(chǎn)生影響。

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