張 宇 王貴泉 張美妮(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，太原 030001)

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是具有軸突損害的一類脫髓鞘性疾病，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)為其經(jīng)典的動(dòng)物模型。很多研究者更多研究小膠質(zhì)細(xì)胞，認(rèn)為其在MS發(fā)病中起主要作用，而近年來，星形膠質(zhì)細(xì)胞在免疫性疾病中的病理生理作用得到了更多關(guān)注?；罨男切文z質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生各種促炎細(xì)胞因子和趨化因子，作為直接或間接的免疫介質(zhì)或炎癥介質(zhì)參與MS病理改變。LCN2是一種脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，以自分泌和旁分泌的方式由星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌，LCN2與星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活JAK2，使STAT3發(fā)生磷酸化，促進(jìn)CXCL10的生成和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化［1］，最終導(dǎo)致脫髓鞘和軸索損害。氟西汀是一種選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(Selective serotonin reuptake inhibitors，SSRI)，本研究通過觀察LCN2、CXCL10在 EAE中的變化，探討氟西汀的可能保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 近交系清潔級(jí)8～10周大小健康雌性C57BL/6小鼠80只，體質(zhì)量18～20 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(健康小鼠)、EAE組、接受紫外線照射模型組(干預(yù)組)及氟西汀組。每組均20只。

1.1.2 主要藥品與試劑 完全弗氏佐劑(CFA)、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(Myelin oligodendrocyte glycoprotein-35-55，MOG35-55)、兔多克隆抗-LCN2 抗體、生物素化山羊抗兔IgG均購自武漢博士德公司;百日咳毒素購自美國Sigma公司;氟西汀(百憂解)生產(chǎn)廠為Patheon France，分包裝廠為禮來蘇州制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫外線照射［2］紫外線照射2 d前剪除各組小鼠頭背部毛發(fā)，剪除面積約3 cm×3 cm。紫外線照射波長(zhǎng)在280～320 nm。紫外線光源距小鼠頭背部無毛發(fā)區(qū)約20 cm，照射時(shí)間為30 s。照射儀器采用Waldmann公司生產(chǎn)的峰值為311 nm窄譜中波紫外線光療儀(TL01)，照射劑量為2 J/cm2，累積照射劑量為60 J/cm2。為了更充分的接受紫外線照射，每只小鼠被放進(jìn)帶有8個(gè)隔斷的籠子里分別進(jìn)行照射。對(duì)照組和EAE組小鼠僅剪除頭背部毛發(fā)，不進(jìn)行紫外線照射。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立、治療及神經(jīng)功能評(píng)分 紫外線照射后1 h［3］，EAE組、干預(yù)組及氟西汀組建立EAE動(dòng)物模型，對(duì)照組為健康小鼠。EAE模型制作過程:用生理鹽水將MOG35-55稀釋成終濃度為3 mg/ml，然后將稀釋液與等體積的完全弗氏佐劑混合，用玻璃注射器抽吸成油包水狀，制成誘導(dǎo)乳劑。按0.2 ml/只給予模型組及干預(yù)組C57BL/6小鼠背部中央偏頭側(cè)皮下4點(diǎn)注射誘導(dǎo)乳劑，于免疫后第0天、第2天分別進(jìn)行腹腔注射百日咳毒素400 ng。致敏當(dāng)天記為第0天［4］。對(duì)照組用生理鹽水+CFA代替誘導(dǎo)乳劑。

于模型動(dòng)物免疫第1天開始并連續(xù)給予氟西汀組小鼠氟西汀(10 mg/kg)灌胃;EAE組、對(duì)照組和干預(yù)組同樣于該組動(dòng)物免疫第1天開始連續(xù)給予生理鹽水(0.2 ml/d)灌胃，均持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。每天稱體質(zhì)量，觀察動(dòng)物行為，并進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。

臨床癥狀評(píng)分分5級(jí):正常或無任何神經(jīng)缺損癥狀，計(jì)為0分;尾部肌張力消失，可見輕度步態(tài)笨拙，計(jì)為1分;尾部無力，雙后肢肌張力低，計(jì)為2分;尾部無力，雙后肢癱瘓，但給予刺激后可挪動(dòng)，計(jì)為3分;癱瘓累及前肢，伴尿便失禁，計(jì)為4分;瀕死狀態(tài)或死亡，計(jì)為5分。癥狀介于兩標(biāo)準(zhǔn)之間以±0.5分計(jì)。動(dòng)物出現(xiàn)臨床癥狀即可以認(rèn)為發(fā)病。照射紫外線過程中2只死亡小鼠退出實(shí)驗(yàn)。小鼠數(shù)量不足按相同方法補(bǔ)足。

1.2.3 組織學(xué)觀察(1)取材:連續(xù)觀察60 d后，各組隨機(jī)抽取6只小鼠腦組織放入4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛中固定、石蠟包埋、切片。(2)采用HE染色及免疫組織化學(xué)染色(具體步驟參見說明書)，在Aperio ScanScope掃描儀下分別觀察各組腦組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度和陽性細(xì)胞的分布并計(jì)數(shù)。免疫組化一抗為兔多克隆抗-LCN2抗體，二抗為生物素化山羊抗兔IgG。一抗稀釋濃度為1∶100。

1.2.4 標(biāo)本采集和CXCL10水平的檢測(cè) 各組于觀察結(jié)束后均隨機(jī)抽取10只小鼠全血，靜置30 min后離心(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司生產(chǎn)的KDC-40低速離心機(jī)，轉(zhuǎn)速:3 000 r/min，離心10 min)，留取每只小鼠血清標(biāo)本約0.3 ml，保存于－80℃冰箱備用。用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定各組小鼠血清CXCL10水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料均采用表示。組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀 EAE組小鼠在免疫后第13～15天發(fā)病，免疫后第20～23天發(fā)病達(dá)高峰，免疫后第28～30天進(jìn)入慢性期。氟西汀組小鼠臨床癥狀較同期EAE組小鼠明顯改善。干預(yù)組平均發(fā)病時(shí)間(22.59±1.121)d，氟西汀組為(42.55±1.508)d，短于氟西汀組(P＜0.05);隨觀察時(shí)間延長(zhǎng)，小鼠臨床癥狀逐漸加重，氟西汀組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能評(píng)分(2.273±1.272)低于干預(yù)組(3.176±1.015)及EAE組(4.200±0.447)(P＜0.05)，干預(yù)組低于EAE組(P＜0.05)。EAE組小鼠全部發(fā)病，氟西汀組小鼠發(fā)病率(55%)明顯低于干預(yù)組(85%)和EAE組(100%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)小鼠神經(jīng)功能評(píng)分變化Fig.1 Variance of nerve function grades of experimental mice

2.2 腦組織病理表現(xiàn)

2.2.1 Aperio ScanScope掃描儀下觀察HE染色EAE組小鼠腦組織伴有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，在腦組織主要集中在軟膜下和腦室周圍白質(zhì)。EAE組小鼠腦組織中可見血管袖套現(xiàn)象和明顯的腦膜炎表現(xiàn)，以單核細(xì)胞浸潤(rùn)為主;干預(yù)組、氟西汀組中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)呈散在性，血管袖套現(xiàn)象消失。隨觀察時(shí)間延長(zhǎng)，慢性期小鼠腦組織中可見顯著的白質(zhì)疏松，巨噬細(xì)胞和多形核細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖2。

圖2 實(shí)驗(yàn)小鼠腦中病理表現(xiàn)Fig.2 Representation of brain in experimental mice

2.2.2 腦組織中LCN2的表達(dá)情況 各組均有陽性細(xì)胞存在，EAE組白質(zhì)空泡形成、疏松明顯，EAE組(57.33±3.670)、氟西汀組(48.00±5.899)和干預(yù)組(49.33±5.785)陽性細(xì)胞數(shù)平均秩次明顯高于對(duì)照組(13.00±3.742)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。氟西汀組和干預(yù)組陽性細(xì)胞數(shù)較EAE組明顯減少(P＜0.05)。氟西汀組陽性細(xì)胞數(shù)較干預(yù)組無明顯變化(P＞0.05)，見圖3。

圖3 實(shí)驗(yàn)小鼠腦組織中LCN2的表達(dá)Fig.3 Expression of LCN2 in brain of experimental mice

2.3 C57BL/6小鼠血清CXCL10含量測(cè)定 CXCL10含量EAE組高于氟西汀組，氟西汀組高于對(duì)照組(P＜0.05)，見表1。

2.4 EAE組60 d小鼠腦組織中LCN2陽性細(xì)胞數(shù)平均秩次和血清CXCL10含量相關(guān)性分析 EAE組小鼠腦組織中LCN2陽性細(xì)胞數(shù)平均秩次和血清CXCL10含量之間的相關(guān)系數(shù)為0.939，雙尾檢驗(yàn)的概率值為0.005(P＜0.01)，結(jié)果顯示二者存在顯著的線性相關(guān)，見圖4。

表1 實(shí)驗(yàn)小鼠外周血清中CXCL10的表達(dá)()Tab.1 Expression of CXCL10 in the peripheral blood plasma of experimental mice()

表1 實(shí)驗(yàn)小鼠外周血清中CXCL10的表達(dá)()Tab.1 Expression of CXCL10 in the peripheral blood plasma of experimental mice()

Note:1)P ＜0.05，vs control group;2)P ＜0.05，vs fluoxetine group;P ＞0.05，vs intervention group;3)P ＜0.05，vs intervention group.

Groups CXCL10 Fluoxetine group 83.69±12.001)3)Intervention group 95.92±10.601)EAE group 97.74±17.641)2)Control group 69.77±12.46

圖4 EAE小鼠腦組織LCN2陽性細(xì)胞數(shù)與血清CXCL10水平相關(guān)性分析Fig.4 Correlation between LCN2 immunopositive cells in brain and CXCL10levelinbloodplasmaof EAE mice

3 討論

MS的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚。免疫炎癥反應(yīng)在EAE的發(fā)病中起到重要作用，星形膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)的免疫效應(yīng)細(xì)胞，促進(jìn)CNS發(fā)生固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答［5］，參與MS的發(fā)病。LCN2是一個(gè)疏水性分子的結(jié)合蛋白，也稱作24P3。Lee等［6］研究證實(shí)在 CNS，LCN2以自分泌的方式由星形膠質(zhì)細(xì)胞生成，作用是促進(jìn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變和細(xì)胞的遷移。Lee等［1］采用DNA微陣列分析方法進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LCN2誘導(dǎo)STAT3肽鏈的絲氨酸和絡(luò)氨酸進(jìn)行磷酸化修飾，促進(jìn)小鼠腦組織中CXCL10的生成，最終導(dǎo)致CNS炎性反應(yīng)和損傷。因此，LCN2在MS和EAE的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，EAE小鼠病程上表現(xiàn)為急性發(fā)作，而非緩解的慢性過程;但可見動(dòng)物存在部分臨床表現(xiàn)恢復(fù)現(xiàn)象，與顏津津等［7］報(bào)道一致。在HE染色中，EAE小鼠腦組織中伴有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，免疫組化結(jié)果顯示LCN2陽性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明LCN2表達(dá)的增加與EAE的發(fā)展有關(guān)。EAE組小鼠LCN2陽性細(xì)胞數(shù)與 CXCL10水平的相關(guān)性分析，證實(shí)LCN2、CXCL10不僅參與EAE的發(fā)病，而且CXCL10表達(dá)的增高與LCN2的分泌有關(guān)。

在不同種系小鼠和不同造模方法前提下，紫外線的作用是不同的。故本實(shí)驗(yàn)采用紫外線照射小鼠，進(jìn)一步觀察其對(duì)C57BL/6小鼠的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干預(yù)組小鼠臨床癥狀較EAE組改善，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織病理學(xué)結(jié)果顯示炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象減少，LCN2陽性細(xì)胞數(shù)較EAE組減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明紫外線照射可以在臨床癥狀和組織病理學(xué)表現(xiàn)方面減輕EAE的發(fā)病。但是血清學(xué)指標(biāo)結(jié)果顯示干預(yù)組與EAE組CXCL10表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)可能是由于紫外線的照射更多的作用于C57BL/6小鼠外周血中其他更敏感的因子，相對(duì)而言對(duì)CXCL10的影響不大;還有可能是實(shí)驗(yàn)小鼠CNS中CXCL10的表達(dá)較外周血中更敏感，在CNS該因子降低的幅度較EAE組更明顯，更有可能得出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是本實(shí)驗(yàn)中沒有更好的反應(yīng)出來。

氟西汀是一種選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑，其可通過增加CNS突觸間隙中5-羥色胺的濃度而調(diào)節(jié)免疫功能，發(fā)揮髓鞘保護(hù)作用［8］，還有可能抑制核因子-κB的激活，減少T細(xì)胞的激活和炎性因子表達(dá)，如腫瘤壞死因子-α和干擾素-γ，還能通過促進(jìn)cAMP效應(yīng)元件的磷酸化的激活，增加腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)［9-11］。本研究結(jié)果顯示，氟西汀組臨床癥狀明顯改善，發(fā)病高峰期神經(jīng)功能評(píng)分較EAE組、干預(yù)組降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;HE染色炎性浸潤(rùn)減少，CXCL10水平較EAE組、干預(yù)組明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，免疫組化結(jié)果顯示氟西汀組與干預(yù)組LCN2陽性細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但氟西汀組、干預(yù)組均與EAE組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明氟西汀對(duì)EAE的保護(hù)作用較紫外線照射更明顯，證明氟西汀可緩解 EAE進(jìn)展，與減少 LCN2的分泌有關(guān)。

綜上所述，LCN2、CXCL10與EAE發(fā)病有關(guān)，氟西汀可緩解EAE發(fā)生、發(fā)展，為臨床治療MS提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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