劉苗苗，韋 芳，潘超安，楊 洋，徐斯偉，周俊梅，張必萌△

(1.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院，上海201620;2.上海市松江樂都醫(yī)院，上海201620)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis)是目前世界上最常見的關(guān)節(jié)退行性病變，每年都會影響百萬人的生活質(zhì)量。這種疾病不僅影響了近10%的老年人的生活，同時(shí)也使得很多年輕人飽受其害［1］。目前的研究表明膝骨關(guān)節(jié)炎是多種因素引起的關(guān)節(jié)軟骨退行性病變［2］，主要病理變化為關(guān)節(jié)腔變窄、透明軟骨缺失、軟骨下硬化、關(guān)節(jié)邊緣骨贅增生等。也有研究發(fā)現(xiàn)膝骨關(guān)節(jié)炎的主要病理變化為滑膜纖維化以及關(guān)節(jié)腔液成分的改變［3］。盡管膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的具體機(jī)制還不明確，但是可以肯定的是引起此病變的機(jī)制不止一種，越來越多的證據(jù)表明滑膜病變在膝骨關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程中有重要地位［4］。膝骨關(guān)節(jié)炎在臨床上的主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)的疼痛、腫脹、僵硬以及活動(dòng)受限，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［5－6］。膝骨關(guān)節(jié)炎的治療主要集中在相關(guān)癥狀的改善上，目前臨床上常用的非甾體抗炎藥，長期服用可產(chǎn)生不同程度的胃腸道不適等副作用［7］，因此尋求一種安全有效的療法一直是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界所關(guān)注的重點(diǎn)，近年來的資料顯示:針灸療法是治療膝骨關(guān)節(jié)炎有效方式之一［6－8］。研究表明:針灸在緩解患者膝關(guān)節(jié)炎引起的疼痛、腫脹等方面有顯著療效，但對其起效的具體機(jī)制尚未明確［9］。

本實(shí)驗(yàn)旨在通過建立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察電針治療膝骨關(guān)節(jié)炎MIA模型大鼠過程中滑膜組織中的基質(zhì)金屬蛋白酶－3(MMP－3)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑－1(TIMP－1)表達(dá)的變化，研究電針對MMP－3和TIMP－1的調(diào)控機(jī)制，為電針治療膝骨關(guān)節(jié)炎的可能作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的清潔級健康3月齡SD雄性大鼠40只，體重在(280±20)g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由本醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心負(fù)責(zé)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置符合科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》［10］以及上海交通大學(xué)倫理委員會對于善待動(dòng)物的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器

一次性 1.5寸華佗牌無菌針灸毫針 0.35×40 mm，蘇食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2008第227 0626號，中國蘇州醫(yī)療用品廠有限公司;華佗牌電子針療儀SDZII型，蘇食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2009第2270366號，中國蘇州醫(yī)療用品廠有限公司;塞來昔布膠囊(商品名:西樂葆，國藥準(zhǔn)字J20080059+H20110474):美國輝瑞制藥有限公司;碘乙酸鈉(MIA):Sigma，美國;Trizol試劑:Sigma，美國;兔抗 MMP－3、TIMP－1多克隆抗體:上海浩朗生物科技有限公司;數(shù)碼相機(jī):尼康，日本。其它涉及的試劑及儀器均由上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 設(shè)計(jì)

隨機(jī)對照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組

將40只雄性大鼠稱重后按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成4組，即正常組、模型組、藥物組和電針組，每組各10只。

2.3 建立動(dòng)物模型

將SD大鼠置于清潔級環(huán)境中，每2只一籠，采用Guingamp C的經(jīng)典MIA造模方法制備大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎 MIA 模型［11］，將0.3 mg單體碘乙酸鈉(MIA)溶液注入大鼠左側(cè)膝骨關(guān)節(jié)腔內(nèi)，并配合持續(xù)的抽屜樣關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)。具體操作步驟為:將3 mg MIA溶入到50 μl 9%的生理鹽水中，清理關(guān)節(jié)附近的鼠毛，將關(guān)節(jié)屈曲到最大限度后于左膝關(guān)節(jié)腔注入配置好的溶液，于右膝處注入同等劑量的生理鹽水，正常組用同樣的方法于兩膝注入50 μl 9%生理鹽水。40只老鼠每天同時(shí)做相同的驅(qū)趕運(yùn)動(dòng)約30 min。

2.4 干預(yù)

實(shí)驗(yàn)兩周后，分別對各組進(jìn)行干預(yù)。正常組:給予正常飲食，其它不作特殊處理。造模組:造模后給予正常飲食，不作任何治療。電針組:穴位常規(guī)消毒后用直徑0.35 mm、長40 mm的華佗牌針灸針進(jìn)行針刺“后三里”穴、“陽陵泉”穴［12－20］。得氣后接通電針治療儀，采用疏密波形，頻率1～4 Hz，輸出強(qiáng)度為1～3 mA，持續(xù)20 min，以局部肌肉輕微抖動(dòng)為度。每日1次，連續(xù)治療14天。藥物組:將塞來昔布溶入到10%的二甲基亞砜(DMSO)中，按照人與動(dòng)物體重?fù)Q算公式 Meeh －Rubner折合成大鼠量［11，19－20］，給予每只大鼠3 mg·(kg－1·2ml－1)灌胃量，每天灌藥 1 次，連續(xù)給藥14天。

Meeh－Rubner換算公式:A=K·W2/3/10 000。

注:A代表體表面積，K代表系數(shù)，W代表體重(g)。

2.5 標(biāo)本的采集與保存

于實(shí)驗(yàn)第4周采用頸椎脫臼法處死全部大鼠，將大鼠固定于固定板上，伸直關(guān)節(jié)，切開皮膚，將整個(gè)關(guān)節(jié)取下攝像保存并作大體觀察。切開皮下組織、深筋膜、切斷內(nèi)外側(cè)副韌帶，顯露出整個(gè)膝關(guān)節(jié)面，肉眼觀察膝關(guān)節(jié)面、關(guān)節(jié)軟骨以及滑膜變化并攝像保存。將膝關(guān)節(jié)置于冰上，用銳利刀片取膝關(guān)節(jié)正中部分的滑膜組織約50 mg，去除周圍的脂肪組織，剪碎分裝置于1.5 ml的離心管中，加入 Trizol試劑0.5 ml手動(dòng)勻漿器攪碎組織，于4℃下1000 g離心20 min，提取上清液置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 標(biāo)本檢測

雙抗體夾心elisa法檢測各組MMP－3和TIMP－1的含量。參考試劑盒說明書配置所需溶液，并配置標(biāo)準(zhǔn)品梯度:MMP －3:2000，1000，500，250，125，62.5，31.2 pg/ml;TIMP －1:800，400，200，100，50，25，12.5 pg/ml。在空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔分別加入50 μl ASSAY稀釋液，然后在空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔分別加入50 μl樣本稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品和樣本;室溫孵育2 h;用洗液沖洗4次;每孔加入100 μl酶結(jié)合物工作液;室溫孵育2 h;用洗液沖洗4次;每孔加入100 μl顯色底物;避光室溫孵育30 min;每孔加入100 μl終止液;混勻，用酶標(biāo)儀在450 nm處測吸光值;繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:以標(biāo)準(zhǔn)品濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，以測得的OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;根據(jù)OD值計(jì)算各個(gè)指標(biāo)含量。

注:各滑膜組織中的MMP－3和TIMP－1濃度用μg/g蛋白來表示。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在本實(shí)驗(yàn)整個(gè)操作過程中未對大鼠造成明顯創(chuàng)傷，故實(shí)驗(yàn)中無大鼠的脫落，40只大鼠全部納入結(jié)果分析。

3.1 動(dòng)物觀察

模型組大鼠在關(guān)節(jié)腔注入MIA后3天左右發(fā)病，以左側(cè)關(guān)節(jié)腫脹、活動(dòng)受限為主，隨著時(shí)間的增加關(guān)節(jié)腫脹持續(xù)加重，部分腫脹關(guān)節(jié)局部皮膚充血、發(fā)亮、增厚，左側(cè)肢體出現(xiàn)跛行，觸摸其左側(cè)關(guān)節(jié)老鼠會有明顯的躲避行為，大鼠整個(gè)狀態(tài)表現(xiàn)為倦怠，進(jìn)食減少，體重約在14天左右開始明顯下降。藥物治療組跟針灸組大鼠的癥狀在14天干預(yù)治療后明顯改善，而造模組則持續(xù)加重。正常組體重增長正常，毛發(fā)光滑，活動(dòng)自如。

3.2 關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)軟骨肉眼觀察

關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)軟骨肉眼觀察見表1及圖1。

表1 SD大鼠離體關(guān)節(jié)大體觀

圖1 SD大鼠離體關(guān)節(jié)大體觀

3.3 4組大鼠滑膜組織中MMP－3和TIMP－1蛋白表達(dá)水平比較

模型組、藥物組、電針組各組 MMP－3、TIMP－1蛋白水平相對表達(dá)量均較正常組顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但在模型組中兩個(gè)指標(biāo)變化并不同步，MMP－3比TIMP－1表達(dá)量增加得多;模型組、藥物組、電針組各組之間兩兩比較，藥物組和電針組中MMP－3和TIMP－1的相對表達(dá)量明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，可見藥物組和電針組對膝骨關(guān)節(jié)炎 MIA模型大鼠滑膜組織中 MMP－3和TIMP－1均有明顯下調(diào)作用，但是藥物組和電針組之間MMP－3和TIMP－1兩個(gè)指標(biāo)的表達(dá)均無顯著性差異(P ＞0.05)。見表2。

表2 各組MMP－3/TIMP在滑膜組織中的表達(dá)量(±s，μg/g)

表2 各組MMP－3/TIMP在滑膜組織中的表達(dá)量(±s，μg/g)

組別 n MMP－3 TIMP－1正常組10 11.91 ±0.31 10.52 ±0.40模型組 10 32.45 ±0.45 13.34 ±0.52藥物組 10 12.37 ±0.67 10.83 ±0.61電針組10 11.90 ±1.24 10.81 ±1.08

4 討論

以往的實(shí)驗(yàn)研究表明大鼠在發(fā)育期雌性較雄性骨量變化有明顯差異［21］，而且雌性大鼠有明顯的生理周期［22］，為了避免自身生理因素給實(shí)驗(yàn)帶來的影響，本研究選用雄性大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

膝骨關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備方法很多［23－24］，本研究采用的是向單側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射單體碘乙酸鈉(MIA)的方法進(jìn)行造模。研究表明［10，25］:單體碘乙酸鈉是一種糖酵解抑制劑，將其注入大鼠單側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)能夠在較短時(shí)間內(nèi)誘發(fā)大鼠形成類似于人體的膝骨關(guān)節(jié)炎病理狀態(tài)。造模后兩周即可出現(xiàn)軟骨表面的凹陷以及裂隙、整個(gè)關(guān)節(jié)增粗等病理表現(xiàn)，造模4周后即可出現(xiàn)滑膜纖維化以及關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)一步裂變，并伴隨骨贅形成。本研究在造模兩周后介入干預(yù)措施，可以有效觀察干預(yù)措施對此病理狀態(tài)的改變和影響。

大量國內(nèi)外臨床研究表明，電針在治療膝骨關(guān)節(jié)炎方面有其獨(dú)特優(yōu)勢，能夠有效緩解膝骨關(guān)節(jié)炎引起的疼痛、關(guān)節(jié)僵硬以及功能性障礙［26］。臨床上，針灸治療膝骨關(guān)節(jié)炎多以局部疏通經(jīng)脈、調(diào)理氣血為主，電針局部“足三里”穴、“陽陵泉”穴可以有效改善膝關(guān)節(jié)局部的血液循環(huán)，減輕滑膜炎癥，起到防衛(wèi)免疫、抗病鎮(zhèn)痛的作用，有利于關(guān)節(jié)炎的恢復(fù)［27］。因此，本研究參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》等，選取大鼠膝關(guān)節(jié)處，與人類膝關(guān)節(jié)“足三里”穴、“陽陵泉”穴相對應(yīng)的“后三里”穴、“陽陵泉”穴進(jìn)行電針治療。此外，相對于傳統(tǒng)針灸治療的方式，針刺后連通電針儀進(jìn)行電針治療，可以準(zhǔn)確掌握刺激參數(shù)，量化刺激強(qiáng)度。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類存在于軟骨細(xì)胞外的蛋白水解酶家族，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)的大多數(shù)蛋白質(zhì)。MMP－3是MMPs家族的主要成員之一，它不僅可以降解細(xì)胞外基質(zhì)膜成分，而且能分泌大量的細(xì)胞外分子［28］，在成纖維細(xì)胞的增生中起著重要的媒介作用［29］。TIMPs是一種內(nèi)源性的、分布廣泛的低分子生理性抑制劑，由滑膜及軟骨細(xì)胞合成，能夠與MMPs以共價(jià)鍵形式結(jié)合成1:1的復(fù)合物，從而抑制絕大多數(shù)的MMPs［30］。研究表明，MMP－3和 TIMP－1能夠相互結(jié)合和制約，是參與膝骨關(guān)節(jié)炎病程發(fā)展的重要物質(zhì)［31］。在膝骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜和軟骨組織中，MMP－3和 TIMP－1的表達(dá)均顯著增加，但TIMP－1增加的程度相對較小，打破了MMP－3和TIMP－1之間原本的平衡［32］，這種失衡狀態(tài)造成膝關(guān)節(jié)軟骨外基質(zhì)降解，使得膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)一系列退變表現(xiàn)。在本研究中，正常組、電針組和藥物組大鼠滑膜組織中亦存在少量MMP－3和TIMP－1且基本保持平衡，意味著可能正是這種動(dòng)態(tài)平衡保證了軟骨細(xì)胞正常的代謝水平，而在模型組MMP－3有明顯的高表達(dá)，隨之TIMP－1的表達(dá)也升高，但是兩者的表達(dá)并不同步，使得MMP－3和TIMP－1的平衡遭到破壞，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，雖然這與之前的另外一篇文獻(xiàn)報(bào)道［18］中MMP－3和TIMP－1的變化趨勢稍有差異，恰好說明了這種平衡可能并非靜止?fàn)顟B(tài)，而是處在一個(gè)動(dòng)態(tài)變化中，電針?biāo)鸬淖饔每赡苷眉m正了兩者之間的不平衡，使兩者歸于平衡狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)采用分子生物學(xué)方法對電針治療大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎MIA模型進(jìn)行了研究，并對電針療法的可能作用機(jī)制進(jìn)行探討，證明了針灸能夠有效糾正MMP－3和TIMP－1在滑膜組織中的異常表達(dá)，從而發(fā)揮治療作用，為針灸治療膝骨關(guān)節(jié)炎提供了可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

注:感謝美國雅培公司的Steve McGaraughty博士對本研究造模部分提供的指導(dǎo)與支持。

［1］Dieppe PA，Lohmander LS.Pathogenesis and management of pain in osteoarthritis［J］.The Lancet，2005，365(9463):965 －973

［2］Blom AB，van Lent PL，Libregts S，et al.Crucial role of macrophages in matrix metalloproteinase－mediated cartilage destruction during experimental osteoarthritis:involvement of matrix metalloproteinase 3［J］.Arthritis ＆ Rheumatism，2007，56(1):147 －157

［3］Leydet－ Quilici H，Le Corroller T，Bouvier C，et al.Advanced hip osteoarthritis:magneticresonance imaging aspects and histopathology correlations［J］.Osteoarthritis and Cartilage，2010，18(11):1429 －1435

［4］Benito MJ，Veale DJ，F(xiàn)itzGerald O，et al.Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis［J］.Annals of the rheumatic diseases，2005，64(9):1263 －1267

［5］Hayashi M，Muneta T，Takahashi T，et al.Intra － articular injections of bone morphogenetic protein－7 retard progression of existing cartilage degeneration［J］.Journal of Orthopaedic Research，2010，28(11):1502－1506

［6］Selfe TK，Taylor AG.Acupuncture and osteoarthritis of the knee:a review of randomized，controlled trials［J］.Family ＆ community health，2008，31(3):247

［7］許傳勇，宋朋飛，闞衛(wèi)兵，等.塞來昔布膠囊對大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞β－catenin和基質(zhì)金屬蛋白酶－7的影響［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2013，34(5):678

［8］Ahsin S，Saleem S，Bhatti AM，et al.Clinical and endocrinological changes after electro－acupuncture treatment in patients with osteoarthritis of the knee［J］.Pain，2009，147(1):60 －66

［9］Scoto GM，Aricò G，Iemolo A，et al.Involvement of the Nociceptin/Orphanin FQ－NOP receptorsystem in the ventrolateral periaqueductal gray following mechanical allodynia in chronic pain［J］.Life sciences，2009，85(5):206 －210

［10］中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部.關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見［EB/OL］.［2011 －07 －09］.

［11］Guingamp C，Gegout－Pottie P，Philippe L，et al.Mono－iodoacetate－induced experimental osteoarthritis.A dose－response study of loss of mobility，morphology，and biochemistry［J］.Arthritis ＆Rheumatism，1997，40(9):1670 －1679

［12］Spiers DE，Candas V.Relationship of skin surface area to body mass in the immature rat:a reexamination［J］.Journal of Applied Physiology，1984，56(1):240 －243

［13］黃劍，卓廉士，王永渝，等.電針對膝骨性關(guān)節(jié)炎家兔模型白介素－1β和腫瘤壞死因子 －α 的影響［J］.針刺研究，2007，32(2):115－118

［14］Huang J，Zhuo LS，Wang YY，et al.Effects of electroacupuncture on synovia free radicals in rabbits with knee osteoarthritis［J］.Acupuncture research，2008，33(2):116

［15］李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2003:327

［16］于船.中國獸醫(yī)針灸學(xué)［M］.北京:農(nóng)業(yè)出版社，1984:212

［17］華興邦，周浩良.大鼠穴位圖譜的研制［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，1991(1):1－5

［18］包飛，孫華，吳志宏，等.針刺對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑表達(dá)的影響［J］.中國針灸，2011，31(3):241－246

［19］Moon SJ，Park JS，Jeong JH，et al.Augmented chondroprotective effect of coadministration of celecoxib and rebamipide in the monosodium iodoacetate rat model of osteoarthritis［J］.Archives of pharmacal research，2013，36(1):116 －124

［20］Mi WL，Mao－Ying QL，Liu Q，et al.Synergistic anti－h(huán)yperalgesia of electroacupuncture and low dose of celecoxib in monoarthritic rats:involvement of the cyclooxygenase activity in the spinal cord［J］.Brain research bulletin，2008，77(2):98 －104

［21］高建軍，周軼，顧淑珠，等.大鼠骨生物學(xué)指標(biāo)的月齡特征［J］.中國骨質(zhì)疏松雜志，2004，10(2):143－146

［22］洪波.生理周期及致癇后雌性大鼠海馬細(xì)胞色素P450芳香化酶的動(dòng)態(tài)表達(dá)［D］.上海:復(fù)旦大學(xué)，2009

［23］陳百成，張靜.骨關(guān)節(jié)炎［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2004

［24］黃振，查和萍，范志勇，等.膝骨關(guān)節(jié)炎的模型構(gòu)建及針灸干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)外治雜志，2012，21(4):54 －55

［25］Guzman RE，Evans MG，Bove S，et al.Mono－iodoacetate－induced histologic changes in subchondral bone and articular cartilage of rat femorotibial joints:an animal model of osteoarthritis［J］.Toxicologic pathology，2003，31(6):619 －624

［26］Ahsin S，Saleem S，Bhatti AM，et al.Clinical and endocrinological changes after electro－acupuncture treatment in patients with osteoarthritis of the knee［J］.Pain，2009，147(1):60 － 66

［27］熊勇，彭銳，夏數(shù)數(shù).兔膝骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中白細(xì)胞介素1β和腫瘤壞死因子α表達(dá)與艾灸的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(41):7700 －7703

［28］Lijnen HR.Matrix metalloproteinases and cellular fibrinolytic activity［J］.Biochemistry(Moscow)，2002，67(1):92 －98

［29］Tolboom TCA，Pieterman E，Vander Laan WH，et al.Invasive properties of fibroblast－like synoviocytes:correlation with growth characteristics and expression of MMP－1，MMP－3，and MMP－10［J］.Annals of the rheumatic diseases，2002，61(11):975 －980

［30］李衛(wèi)平，蹇睿，胥方元.基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物與骨性關(guān)節(jié)炎［J］.西南軍醫(yī)，2010，12(6):1165 －1167

［31］Fukui N，Zhu Y，Maloney WJ.Stimulation of BMP －2 expression by pro－inflammatory cytokines IL－1 and TNF－alpha in normal and osteoarthritic chondrocytes［J］.The Journal of Bone ＆ Joint Surgery，2003，85(suppl_3):59 －66

［32］Hegemann N，Wondimu A，Ullrich K，et al.Synovial MMP－3 and TIMP－1 levels and their correlation with cytokine expression in canine rheumatoid arthritis［J］.Veterinary immunology and immunopathology，2003，91(3):199 －204