張敏哲，周曉榕，龐保平，韓海斌

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草地昆蟲研究中心，呼和浩特 010019)

蝗災(zāi)是一種世界性生物災(zāi)害，全世界發(fā)生蝗災(zāi)的面積達(dá)4680 萬km2，全球1/8的人口常受到蝗災(zāi)的襲擾。全世界已發(fā)現(xiàn)蝗蟲1 萬多種，我國已知有900 多種，為害較嚴(yán)重的有30 多種(陳永林，2007)。內(nèi)蒙古草原是歐亞大陸草原的重要組成部分，是我國北方溫帶草原中最具代表性的植被類型，約占我國天然草原面積的1/4，也是我國北方重要的生態(tài)屏障?；认x是內(nèi)蒙古草原生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，已鑒定95 種，隸屬于5 科40屬(馬耀等，1991)。但目前關(guān)于內(nèi)蒙古草原蝗蟲系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的研究卻不多見。

線粒體DNA (mtDNA)為細(xì)胞核外遺傳信息載體，具有共價(jià)閉合環(huán)形雙鏈結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)較簡單，分子質(zhì)量小等特點(diǎn)。一般認(rèn)為，mtDNA 中的16S rDNA基因較保守，其進(jìn)化速率慢，適合較高分類單元的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化的研究，是常用線粒體分子標(biāo)記，可用于屬、種間系統(tǒng)發(fā)育分析(陳愛輝和蔣國芳，2004;Nagaraja et al.，2004;Marquez et al.，2007)。Flook 和Rowell (1997)最早應(yīng)用mtDNA 中12S 和16S rDNA 序列研究了直翅目蝗蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，隨后16S rDNA 序列被廣泛地應(yīng)用于直翅目昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究(印紅等，2003;胡靖等，2004;劉殿鋒等，2005;Lu et al.，2006;孫正莉等，2006;崔愛明等，2012)。近年來，為了更好地揭示昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，有學(xué)者開始將16S rDNA 序列結(jié)合其他基因序列共同分析蝗蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，如Gómez 等(2012)結(jié)合3個(gè)線粒體基因:細(xì)胞色素c 氧化酶亞基II、16S rRNA 和12S rRNA 基因，研究了北美的直翅目蝗科帶翅蝗蟲屬Encoptolophus的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。本文測定了內(nèi)蒙古11 種主要草原蝗蟲線粒體16S rDNA序列，構(gòu)建了其系統(tǒng)發(fā)育樹，以期為揭示內(nèi)蒙古草原蝗蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系提供必要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蝗蟲種類、采集地點(diǎn)及時(shí)間見表1。

表1 供試樣本信息Table 1 Information on test samples

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蝗蟲基因組DNA 提取

采用天根dp304 動(dòng)物基因組試劑盒提取提取蝗蟲后足股節(jié)肌肉DNA。將DNA 統(tǒng)一稀釋到50 ng/μL，用做PCR 擴(kuò)增，在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆弥罰CR 擴(kuò)增。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

PCR 擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)參照Emerson 等經(jīng)過修訂的16S 基因通用引物，本研究所用引物為:上游引物:5'-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3';下游引物:5'-CCGGTCTGAACTCAGATCACG-3'，由上海生工生物工程有限公司合成。

在50μL的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系中包括:DNA模板2μL、10× PCR Buffer5μL、dNTP mix(2.5 mmol/L each) 4μL、上下游引物(10μmol/L)各2μL、TaKaRa Taq (5 U/μL)0.6μL (大連寶生物工程有限公司)、ddH2O 補(bǔ)足至50μL。

擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性3 min;35個(gè)循環(huán)的94℃變性45 s，59℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min;72℃延伸7 min;4℃保溫。PCR 儀為BIO-RAD。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠中加入4μL 核酸染料，電泳條件為100 V/30 min，在紫外檢測儀上觀察照相。觀察得到條帶整齊，明亮，無雜帶，達(dá)到實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)，將PCR 產(chǎn)物送到生物公司測序，共送去55個(gè)樣品。

1.2.4 產(chǎn)物序列測定與序列分析

委托上海生物工程有限公司對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果序列與Genbank 中已知蝗蟲的16S 序列對比得到496 bp-525 bp的16S 序列，使用DNAsp 軟件計(jì)算遺傳分化系數(shù) FST;使用MEGA4.0 軟件對蝗蟲的16S 序列進(jìn)行比較分析，分別計(jì)算其堿基含量，遺傳距離，選取基于Kimura-2-Parameter 雙參數(shù)模型 (Kimura，1980)，根據(jù)遺傳距離采用 NJ、ME、MP 及UPGMA 聚類法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹同時(shí)用Bootstrap 1000 次檢驗(yàn)系統(tǒng)樹中各分支的置信度(Felsenstein，1985)，來推演系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 結(jié)果分析

通過退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)，尋找最適的退火溫度，引物的退火溫度梯度為:43℃，44.1℃，46℃，48.9℃，52.7℃，55.7℃，57.7℃，59.0℃。通過退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)優(yōu)化退火溫度后在紫外檢測儀上看到的明亮整齊的PCR 條帶。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳總是產(chǎn)生大小相同的一條帶，根據(jù)MARKER 計(jì)算條帶的分子量在500-700 之間，沒有出現(xiàn)雜帶(圖1)，說明不存在假基因的干擾，PCR 反應(yīng)靈敏，引物特異性好，能用于測序分析。

圖1 蝗蟲16S rDNA PCR 圖Fig.1 PCR results of grasshopper 16S rDNA

2.2 數(shù)據(jù)描述

2.2.1 序列組成

線粒體DNA 16S rDNA 基因片段，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測序得到500 bp 左右，對序列進(jìn)行剪輯，剪切得到505 bp。采用MEGA 中的統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算它們的堿基平均含量分別為:T 38.6%、C 12.2%、A 31.2% 及 G 18.1%;序列中 G+C 含量為:30.2%，A+T 含量為:69.8%;11 種蝗蟲在16S rDNA基因片段序列上表現(xiàn)出A/T 偏向性。在505 bp個(gè)堿基中檢測到156個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，占堿基總數(shù)的30.9%。156個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中包括50個(gè)單變異多態(tài)性位點(diǎn)，占總位點(diǎn)數(shù)的32.1%，和106個(gè)簡約信息位點(diǎn)，占總位點(diǎn)數(shù)的67.9%。

2.2.2 遺傳分化系數(shù)

遺傳分化系數(shù)FST(F-statistic)可以有效反映種間的遺傳分化程度。由表2 可知，各種間的遺傳分化系數(shù)在0.0000-0.9927 之間。黃脛異迦蝗與寬須蟻蝗之間遺傳分化系數(shù)最高(0.9927)，其次為寬須蟻蝗與鼓翅皺膝蝗(0.9890)，再次為黃脛異痂蝗與毛足棒角蝗(0.9888)。黃脛異痂蝗與紅翅皺膝蝗、黃脛異痂蝗與鼓翅皺膝蝗之間以及紅翅皺膝蝗與鼓翅皺膝蝗之間的FST值均為0，說明它們之間的親緣關(guān)系最近。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)得到的11 種蝗蟲序列，結(jié)合Genbank 中6個(gè)已知序列的蝗蟲 (網(wǎng)翅蝗科:白紋雛蝗Chorthippus albonemus、東方雛 蝗 Chorthippus intermedius、浦氏竹 蝗 Ceracris pui、紅股竹 蝗Ceracris versicolor;斑翅蝗科:云斑車蝗Gastrimargus marmoratus 和飛蝗Locusta migratoria)，采用NJ、ME、MP、UPGMA 4 種聚類方法構(gòu)建17 種不同蝗蟲mtDNA 16S rDNA 序列分子系統(tǒng)樹(圖2)。4 種分子系統(tǒng)樹得到的結(jié)果基本一致，表明，槌角蝗科、斑腿蝗科與網(wǎng)翅蝗科3個(gè)科的蝗蟲先聚在一

起，再與斑翅蝗科相聚。4 科的17 種蝗蟲可以聚為6支。第1支為，網(wǎng)翅蝗科雛蝗屬的白紋雛蝗和東方雛蝗聚在一起再與槌角蝗科的毛足棒角蝗和寬須蟻蝗相聚;網(wǎng)翅蝗科竹蝗屬的浦氏竹蝗和紅股竹蝗聚為第2支;斑腿蝗科的短星翅蝗和黑腿星翅蝗聚為第3支;網(wǎng)翅蝗科的寬翅曲背蝗為第4支;斑翅蝗科的亞洲小車蝗、云斑車蝗和東亞飛蝗聚為第5支;斑翅蝗科痂蝗亞科皺膝蝗的鼓翅皺膝蝗和紅翅皺膝蝗相聚與同一亞科的白邊痂蝗相聚再與聚在一起的異痂蝗亞科的黃脛異痂蝗和輪紋異痂蝗相聚為第6支。UPGMA 法將同一亞科的東亞飛蝗和云斑車蝗先聚在一起再與亞洲小車蝗相聚，另外3 種聚類方法都將亞洲小車蝗與東亞飛蝗先聚在一起;ME 聚類法將斑腿蝗科的兩種蝗蟲與網(wǎng)翅蝗科分開。MP 聚類法顯示，寬須蟻蝗與網(wǎng)翅蝗科雛蝗屬的兩種蝗蟲的親緣關(guān)系近于毛足棒角蝗，與其他3 種聚類法不同。

表2 11 種蝗蟲的遺傳分化系數(shù)FSTTable 2 The genetic differentiation coefficient of 11 kinds of locusts FST

圖2 17 種蝗蟲的系統(tǒng)樹Fig.2 Dendrogram of 17 grasshopper species

3 結(jié)論與討論

昆蟲mtDNA 序列是研究種屬間系統(tǒng)發(fā)育較好的分子標(biāo)記。一般認(rèn)為線粒體16S rDNA 是動(dòng)物種內(nèi)個(gè)體間較為保守的序列，適合于高級分類單元起源的探討(Kambhampati et al.，1996;Flook et al.，1999;Hebsgaard et al.，2004)。本文聚類結(jié)果表明，槌角蝗科、斑腿蝗科與網(wǎng)翅蝗科3個(gè)科的蝗蟲先聚在一起，再與斑翅蝗科相聚，一般情況均為相同屬的蝗蟲相聚，再與同一亞科的蝗蟲聚在一起，但是網(wǎng)翅蝗科除外，聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)翅蝗科雛蝗屬兩種蝗蟲與槌角蝗科的毛足棒角蝗和寬須蟻蝗的關(guān)系較近，網(wǎng)翅蝗科竹蝗屬兩個(gè)種與斑腿蝗科的短星翅蝗和黑腿星翅蝗的關(guān)系較為接近，而網(wǎng)翅蝗科的寬翅曲背蝗單獨(dú)聚為一支，與同科的其他種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。4 種聚類方法得到的聚為結(jié)果基本一致，其中只有UPGMA 法將同一亞科的東亞飛蝗和云斑車蝗先聚在一起再與亞洲小車蝗相聚，所以本文中使用UPGMA 聚類結(jié)果與傳統(tǒng)的基于形態(tài)特征的蝗總科分類體系更為接近。

關(guān)于蝗蟲主要科及亞洲小車蝗的親緣關(guān)系，目前的研究結(jié)果不甚一致。本文結(jié)果表明，槌角蝗科、斑腿蝗科與網(wǎng)翅蝗科3個(gè)科的蝗蟲先聚在一起，再與斑翅蝗科相聚。任竹梅等(2002)和印紅等(2003)分別應(yīng)用mtDNA cytb 和16S rDNA序列對蝗總科部分種類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果表明槌角蝗科先與網(wǎng)翅蝗科相聚，再與斑腿蝗科相聚，再與斑翅蝗科相聚。韓海斌等(2013)應(yīng)用rDNA-ITS2 序列研究結(jié)果表明，槌角蝗科先與網(wǎng)翅蝗科相聚，再與斑翅蝗科相聚，最后與斑腿蝗科相聚。本文結(jié)果表明，亞洲小車蝗與同科的飛蝗和云斑車蝗親緣關(guān)系最近。高書晶等(2010)應(yīng)用RAPD的研究結(jié)果表明，亞洲小車蝗與同科的白邊痂蝗親緣關(guān)系最近，但與同科的紅翅皺膝蝗和鼓翅皺膝蝗親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。韓海斌等(2013)表明，亞洲小車蝗與同科的其他5 種蝗蟲親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。

綜上所述，有關(guān)蝗總科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及網(wǎng)翅蝗科所屬蝗蟲的分類地位，還有待于今后進(jìn)一步的研究。

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