朱春亞，劉 歡，曹 溪，張茂新，凌 冰

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生態(tài)研究室，廣州 510642)

苦瓜Momordica charantia L.屬于葫蘆科植物，廣泛分布于熱帶非洲和亞洲(Grover et al.，2004;Subratty et al.，2005)，是一種常見蔬菜，因其全株包括果實(shí)味極苦而得名。與其他葫蘆科植物相比，苦瓜的生長(zhǎng)更少受到蟲害的為害。大量研究證實(shí)，苦瓜葉片中含有豐富的具抗蟲活性的次生物質(zhì)，它們對(duì)多種農(nóng)業(yè)害蟲有明顯的拒食、抑制生長(zhǎng)發(fā)育作用和毒殺作用(Chandravadana and Pai，1987;Yasui et al.，1998;Abe and Matsuda，2000;李紹勤等，2001;凌冰等，2009;駱穎等，2012)。

但有關(guān)苦瓜次生物質(zhì)對(duì)昆蟲作用機(jī)制的研究卻很少。駱穎等測(cè)定了苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)斜紋夜蛾幼蟲中腸蛋白酶和淀粉酶活性的影響(駱穎等，2012)，而對(duì)昆蟲其它酶系的影響尚未見報(bào)道。藻糖酶可以將昆蟲體內(nèi)的海藻糖水解成葡萄糖而被昆蟲利用，在昆蟲的能量代謝上扮演著重要角色(王軍娥和劉靜，2009)。羧酸酯酶、堿性磷酸酯酶、酸性磷酸酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶是昆蟲抵抗外來有毒物質(zhì)的重要解毒酶系，可參與植食性昆蟲對(duì)植物次生物質(zhì)的抗性，對(duì)維持昆蟲的正常生理代謝起重要作用 (陳長(zhǎng)琨，1993;陳鳳菊等，2003)。我們研究了苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)亞洲玉米螟 Ostrinia furnacalis(Güenée)幼蟲體內(nèi)上述酶系活性的影響，旨在闡明苦瓜葉片抗蟲次生物質(zhì)的作用機(jī)理，為能將其開發(fā)為一類新型的具有良好環(huán)境和諧性的植物性殺蟲劑提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，對(duì)進(jìn)一步揭示苦瓜抗蟲的化學(xué)機(jī)制有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑與化學(xué)試劑

供試藥劑是從苦瓜葉乙醇粗提物中用乙酸乙酯萃取獲得的膏狀物(凌冰等，2008);化學(xué)試劑:α-萘酚、α-乙酸萘酯、固藍(lán)鹽B、SDS、硫代碘化乙酰膽堿、5，5-二硫基-雙-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、牛血清蛋白、還原型谷胱甘肽等均為Sigma 公司產(chǎn)品;毒扁豆堿和1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)為BBL 公司產(chǎn)品;對(duì)硝基苯基磷酸二鈉和對(duì)硝基酚為Amresco 公司產(chǎn)品;考馬斯亮藍(lán)G250為北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.2 供試蟲源及飼養(yǎng)方法

亞洲玉米螟由中山大學(xué)提供，采用陳其津(2000)的飼料配方在室內(nèi)繁殖3 代。嚴(yán)格挑選發(fā)育均一的3 齡幼蟲，饑餓4 h，然后分別用添加了不同劑量苦瓜葉乙酸乙酯萃取物的人工飼料飼養(yǎng)72 h?？喙先~乙酸乙酯萃取物添加到人工飼料時(shí)，先配制成不同濃度的丙酮溶液，當(dāng)人工飼料冷卻至40℃時(shí)，按飼料與藥液等于5∶1的比例加入人工飼料中充分混勻，對(duì)照飼料中亦加入等量的丙酮。

1.3 酶液的制備

幼蟲15 頭一組放入預(yù)冷的玻璃勻漿器中，加入5 mL pH7.0的0.1 mol/L 磷酸緩沖液在冰浴條件下勻漿。勻漿液在4000 r/min、4℃離心10 min，取上清液作酶源，-20℃保存待測(cè)。

1.4 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)亞洲玉米螟不同酶活力的影響測(cè)定

1.4.1 海藻糖酶活性測(cè)定:參照鐘國(guó)華等(2000)的方法。用0.02 mol/L的PBS 緩沖液(pH5.8)5 mL 提取酶液。取0.25 mL 酶液加入0.5 mL 2 mmol/L海藻糖標(biāo)準(zhǔn)液中混勻，在37℃水浴中培養(yǎng)60 min。取1 mL 反應(yīng)液，加入3，5-二硝基水楊酸試劑2 mL，混勻，沸水浴加熱5 min，冷卻后用iMark 酶標(biāo)儀13601 (伯樂)測(cè)定其550 nm處的光密度值(OD)。以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算葡萄糖含量，酶活力以μmol(葡萄糖)/mg (蛋白質(zhì))·min 表示。

1.4.2 磷酸酯酶活力測(cè)定參照Bessey (1946)的方法。酸性磷酸酯酶活力的測(cè)定，取酶液0.2 mL加入到2.3 mL的0.2 mol/L 醋酸緩沖液(pH4.6)中，再加入0.0075 mol/L 對(duì)硝基苯基磷酸二鈉0.5 mL，37℃水浴30 min 后加入2.0 mL的0.1 mol/L氫氧化鈉溶液混勻，測(cè)其400 nm 處的OD 值。堿性磷酸酯酶活力的測(cè)定是用0.05 mol/L碳酸緩沖液(pH10.0)代替0.2 mol/L 醋酸緩沖液，其他均與酸性磷酸酯酶測(cè)定方法相同。用對(duì)-硝基苯酚作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力。

1.4.3 羧酸酯酶活力測(cè)定:參照Van Asperene(1962)的方法。取上述10μL 酶液加入3.49 mL 0.04 mol/L 磷酸緩沖液(pH7.0)中混勻，再加入0.5 mL 4×10-4mol/L的α-乙酸萘酯液，37℃水浴30 min 后加入0.5 mL 顯色劑(0.1%固牢藍(lán)B鹽與SDS 溶液按2 ∶5 混合)終止反應(yīng)，靜置10 min，用iMark 酶標(biāo)儀13601 (伯樂)測(cè)定其600 nm 處的光密度值。重復(fù)3 次(下同)。以不同濃度的α-萘酚作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活力測(cè)定:參照Booth (1961)方法。反應(yīng)混合液含0.1 mL 酶液，2.9 mL 0.1 mol/L的磷酸緩沖液 (pH8.0)、0.7 mL 0.03 mol/L的谷胱甘肽液和 50μL 0.1 mol/L的CDNB 液，在25℃水浴中反應(yīng)30 min后加熱使其失活，測(cè)定350 nm 處OD 值。

1.5 可溶性蛋白含量測(cè)定

采用Brandford (1976)法測(cè)定，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，測(cè)定可溶性蛋白含量。實(shí)驗(yàn)求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 Y=0.0693x+0.0044，R2=0.9968。

1.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

獲得的數(shù)據(jù)采用SAS 9.0 版軟件的方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。并用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法(Duncan's multiple range test，DMRT)檢驗(yàn)不同濃度處理間的差異顯著性(P=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)亞洲玉米螟幼蟲海藻糖酶的抑制作用

用含有0.025%-0.4% 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物的飼料飼喂3 齡亞洲玉米螟幼蟲，24 h、48 h 和72 h 分別測(cè)定其海藻糖酶比活力。圖1 顯示了不同劑量的苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)亞洲玉米螟幼蟲海藻糖酶活性的影響。結(jié)果表明，0.025%-0.4%苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)亞洲玉米螟幼蟲海藻糖酶活力均有明顯的抑制作用。隨著苦瓜葉乙酸乙酯萃取物濃度的增加，海藻糖酶的比活力逐漸降低，且明顯低于對(duì)照(24 h:F5，17=25.83，P＜0.0001;48 h:F5，17=101.98，P＜0.0001;72 h:F5，17=71.03，P＜0.0001);隨著苦瓜葉乙酸乙酯萃取物處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)海藻糖酶活力的抑制作用也逐漸增強(qiáng)。處理24 h-72 h，0.2%萃取物處理的相對(duì)活力(以對(duì)照比活力為100%)平均比對(duì)照減少了32.3%，0.4%處理的相對(duì)活力平均比對(duì)照減少了40.8%。

圖1 不同濃度苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)亞洲玉米螟幼蟲海藻糖酶的相對(duì)活力Fig.1 Changes of trehalas relative activity dependent on dosage of theethyl acetate extracts of Momordica charantia leaves in larvae of Ostrinia Furnacalis

2.2 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)亞洲玉米螟幼蟲磷酸酯酶活性的抑制作用

不同濃度苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)亞洲玉米螟幼蟲堿性磷酸酯酶和酸性磷酸酯酶活性的影響見圖2。從圖2A 可以看出，苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)亞洲玉米螟幼蟲堿性磷酸酯酶的活性有明顯抑制作用。處理24 h、48 h 和72 h，除了低濃度(0.0125%)苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)該酶活力的影響與對(duì)照差異不顯著外，0.05%以上濃度處理組堿性磷酸酯酶比活力均顯著低于對(duì)照 (24 h:F5，17=65.68，P＜0.0001;48 h:F5，17=107.58，P＜0.0001;72 h:F5，17=6.05，P=0.0051)。處理24-72 h，0.2%處理的相對(duì)活力平均比對(duì)照減少了34.1%。

從圖2B 可以看出，處理24 h，0.0125%-0.1%苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)酸性磷酸酯酶活力均表現(xiàn)出誘導(dǎo)效應(yīng)，相對(duì)活力比對(duì)照高出48%-67%(F5，17=36.29，P＜0.0001)，而高濃度(0.2%)處理的相對(duì)活力與對(duì)照差異不顯著。處理48 h 和72 h，除了低濃度(0.0125%)處理酸性磷酸酯酶活力與對(duì)照差異不顯著外，0.05%以上的濃度均有明顯的抑制作用，酸性磷酸酯酶比活力均顯著低于對(duì)照(48 h:F5，17=98.11，P＜0.0001;72 h:F5，17=31.87，P＜0.0001)?？喙先~乙酸乙酯萃取物處理初期對(duì)酸性磷酸酯酶活性的誘導(dǎo)作用可能是蟲體對(duì)外源物的一種應(yīng)急反應(yīng)，隨后的被抑制現(xiàn)象可能因?yàn)橄x體的生理機(jī)能下降引起的。

圖2 不同濃度苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)亞洲玉米螟磷酸酯酶的相對(duì)活力Fig.1 Changes of phosphatase relative specific activity dependent on dosage of the ethyl acetate extracts of Momordica charantia leaves in larvae of Ostrinia furnacalis

2.3 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)亞洲玉米螟羧酸酯酶活性的影響

從圖3 可以看出，在處理后24 h，0.0125%-0.2%苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)羧酸酯酶活性均有明顯的抑制作用，其抑制作用隨著苦瓜葉乙酸乙酯萃取物濃度的增加而增強(qiáng)(24 h:F5，17=36.29，P＜0.0001);但48 h，0.0125%-0.1%處理組羧酸酯酶的活性逐漸恢復(fù)，與同期對(duì)照差異不顯著，高濃度(0.2%)處理表現(xiàn)出一定的誘導(dǎo)作用(48 h:F5，17=4.11，P=0.0208)。72 h，各濃度處理羧酸酯酶活性均與同期對(duì)照差異不顯著(72 h:F5，17=1.52，P=0.2542)。

圖3 不同濃度苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)亞洲玉米螟羧酸酯酶的比活力Fig.3 Changes ofcarboxyl esterases specificactivity dependent on dosage of of the ethyl acetate extracts of Momordica charantia leaves in larvae of Ostrinia furnacalis

2.4 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)亞洲玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性的影響

從表1 可以看出，含有低濃度(0.0125%和0.025%)苦瓜葉乙酸乙酯萃取物的飼料飼喂亞洲玉米螟3 齡幼蟲24 h 和48 h 后，對(duì)其谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性沒有明顯的影響，但用0.05%以上的濃度飼喂對(duì)亞洲玉米螟幼蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性卻有明顯的誘導(dǎo)作用(24 h:F5，17=17.79，P＜0.0001;48 h:F5，17=20.34，P＜0.0001)。72 h，隨著亞洲玉米螟幼蟲的不斷取食，苦瓜葉乙酸乙酯萃取物在其體內(nèi)的積累逐漸增多，對(duì)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)作用亦隨著增強(qiáng)，低濃度(0.0125%和0.025%)的處理也表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)作用(72 h:F5，17=73.72，P＜0.0001)。

3 結(jié)論與討論

苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)小菜蛾、斜紋夜蛾等害蟲具有明顯的拒食、胃毒及抑制生長(zhǎng)發(fā)育和生殖力的作用(凌冰等，2008;駱穎等，2012)，這可能與其對(duì)代謝酶活性的影響有關(guān)。本研究結(jié)果表明，苦瓜乙酸乙酯萃取物可顯著抑制亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)海藻糖酶活性，同時(shí)，對(duì)堿性磷酸酯酶和酸性磷酸酯酶活性也有明顯的抑制作用，且隨著苦瓜葉乙酸乙酯萃取物濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)其抑制作用逐漸增強(qiáng)。海藻糖酶在昆蟲的能量代謝、生長(zhǎng)發(fā)育及生殖腺和生殖細(xì)胞發(fā)育等方面起重要作用(Selvisabhanayakam，et al.，1993;鐘國(guó)華等，2000)。磷酸酯酶(包括堿性磷酸酯酶和酸性磷酸酯酶)不僅在昆蟲體內(nèi)核苷酸、磷蛋白和磷脂的代謝中起重要作用，而且對(duì)外源化合物的解毒代謝也起著重要作用(徐艷聆等，2007)。昆蟲體內(nèi)海藻糖酶和磷酸酯酶活性受到抑制，將破壞昆蟲正常生理功能，導(dǎo)致昆蟲生理代謝紊亂，生長(zhǎng)發(fā)育受阻。因此，苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)海藻糖酶和磷酸酯酶活性的抑制作用可能與其毒殺和抑制昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育作用有關(guān)。另外，本研究結(jié)果表明，苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)羧酸酯酶活性的影響是隨處理時(shí)間而變化的，表現(xiàn)為先抑制，后逐步被激活、再恢復(fù)的變化過程。周瓊等(2011)用環(huán)氧蒼耳素I 處理菜青蟲后，其中腸羧酸酯酶的活性也表現(xiàn)出先抑制后升高的現(xiàn)象。羧酸酯酶是昆蟲體內(nèi)一類重要的解毒酶系，不同植物次生物質(zhì)對(duì)昆蟲羧酸酯酶活性的影響是不同的。張愛萍等(2008)報(bào)道用0.01-1.0 mg/mL 槲皮素對(duì)B 型煙粉虱羧酸酯酶活性有明顯的誘導(dǎo)作用，而0.1-0.5 mg/mL的2-十三烷酮和0.75-30.00 mg/mL葫蘆素B 則表現(xiàn)出明顯的抑制作用，這表明不同植物次生物質(zhì)對(duì)昆蟲羧酸酯酶同工酶組成的影響是不同的。苦瓜葉乙酸乙酯萃取物進(jìn)入亞洲玉米螟體內(nèi)后先抑制了羧酸酯酶活性，從而抑制了昆蟲的正常生理代謝。隨著亞洲玉米螟取食時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)入其體內(nèi)的苦瓜葉乙酸乙酯萃取物濃度不斷提高，由于解毒功能的需要，部分羧酸酯酶同工酶被誘導(dǎo)激活。這可能是亞洲玉米螟對(duì)外界刺激的一種適應(yīng)機(jī)制。

表1 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)亞洲玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性的影響Table 1 Effect of the ethyl acetate extracts of Momordica charantia leaves on GSH-S-transferase specific activity in larvae of Ostrinia furnacalis

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶是昆蟲體內(nèi)重要的解毒代謝酶，對(duì)外源化合物的解毒代謝起著重要作用(謝苗和尤民生，2011)。已有的研究表明，植物次生物質(zhì)可誘導(dǎo)昆蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性(董向麗等，1998;董鈞鋒等，2002;呂敏等，2012)，可能與昆蟲與植物的長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化有關(guān)，一方面植物會(huì)分泌有毒植物次生物質(zhì)來抵御昆蟲的侵害，另一方面，植食性昆蟲為了應(yīng)對(duì)植物的化學(xué)防御，其體內(nèi)的解毒酶系活性同時(shí)被誘導(dǎo)，從而增強(qiáng)了昆蟲對(duì)植物次生物質(zhì)的解毒作用，使昆蟲免受次生物質(zhì)的影響(Després et al.，2007;Piskorski et al.，2011)。我們的研究結(jié)果顯示，苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶有顯著的誘導(dǎo)作用，并表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，說明谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶在對(duì)苦瓜葉乙酸乙酯萃取物的解毒過程中發(fā)揮重要作用。

本研究表明，苦瓜乙酸乙酯萃取物可顯著抑制亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)海藻糖酶活性，說明該酶有可能是其的作用靶標(biāo)之一。鑒于哺乳動(dòng)物體內(nèi)不存在內(nèi)源性的海藻糖，許多科學(xué)家認(rèn)為研究和開發(fā)以海藻糖酶為靶標(biāo)的新型殺蟲劑將成為今后的新方向(鐘國(guó)華等，2000;楊艷等，2005;王軍娥和劉靜，2009;于彩虹等，2011)。目前，我們已從苦瓜葉乙酸乙酯萃取物中分離得到具有生物活性的momordicin I、momordicin II、3β，7β，25-trihydroxy-cucurbita-5，23-dien-19-al 和3β，7β，25-trihydroxycucurbita-5，23-dien-19-al-3-O-β-D-glucopyranoside 等化合物，有關(guān)這些化合物對(duì)昆蟲海藻糖酶及相關(guān)代謝酶的作用機(jī)理有待研究。本研究為進(jìn)一步了解和揭示這些活性物質(zhì)的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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