石永春，楊永銀，劉衛(wèi)群

河南農業(yè)大學生命科學學院，鄭州文化路95號 450002

生物技術

煙草SOC1基因的克隆和表達分析

石永春，楊永銀，劉衛(wèi)群

河南農業(yè)大學生命科學學院，鄭州文化路95號 450002

為明確SOC1基因在葉片中的生理作用，克隆到煙草中SOC1基因的完整開放閱讀框，全長806 bp。農桿菌介導轉化煙草后，獲得26棵轉基因植株，其中23棵鑒定為陽性植株，轉化率為88.46%。與野生型煙草K326相比，獲得的SOC1過表達煙株開花提前，株高增加，葉片寬大。半定量RT-PCR結果顯示，SOC1過表達不影響葉片中Rubisco大亞基、蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶基因的表達水平，但提高了抗壞血酸氧化酶的表達水平；提高了碳酸酐酶活性、蔗糖含量和還原性抗壞血酸含量，并降低了抗壞血酸過氧化物酶活性。表明SOC1可能通過影響氧化還原狀態(tài)而提高碳酸酐酶活性和光合速率。

煙草；SOC1；轉基因；光合；抗壞血酸

MADS-box類轉錄因子參與植物生長發(fā)育的多個方面，尤其在生殖器官發(fā)育方面起到重要作用，但也參與營養(yǎng)生長的調控[1]。SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANTS 1（SOC1） 基因屬MADS-box轉錄因子家族，在植物的莖頂端分生組織和葉片中都有表達，和成花誘導關系密切[2]。擬南芥中存在四種成花途徑——春化（低溫）、赤霉素、自主途徑和光周期途徑，前三條途徑都通過促進莖頂端分生組織中SOC1的表達[3]激活LEAFY（LFY）基因，最終導致頂端分生組織形成花原基[4]。SOC1基因還與植物對短期或長期低溫響應的切換密切相關[5]。

值得注意的是，SOC1也被發(fā)現在葉片中表達[2]。已發(fā)現在擬南芥的葉片中，光周期通過促進CO基因的表達而增加韌皮部Flowering locus T（FT）蛋白的產量。FT蛋白經韌皮部轉運至頂端分生組織中，與Flowering locus D（FD）蛋白一起激活SOC1的表達并促進成花[6]。但在葉片中，SOC1是否與光周期有關，是否參與葉片生長的調控，未見報道。

煙草是以葉片為收獲對象的經濟作物，明晰葉片發(fā)育的調控機理是獲得優(yōu)質煙葉的分子理論基礎。因此，獲得SOC1轉基因煙草，不僅是研究SOC1基因在煙葉中生理功能的必要材料，還為研究SOC1是否影響煙葉發(fā)育和品質的分子機理做一鋪墊。本研究對煙草中的SOC1基因進行克隆和轉化，并對SOC1在葉片中的生理作用做一初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草(Nicotiana tabacum cv.K326)種子放在襯有濕潤濾紙的平皿里萌發(fā)，而后放在25/16 ℃ day/night的培養(yǎng)間中，每天給予16 h的250 μM m-2·s-1光照。相對濕度為65%～75%。10 d后，小苗被轉入單獨的營養(yǎng)缽中培養(yǎng)至8葉期，并在上午9點的光照時間采收檢測。

菌種Escherichia coli DH5α從大連寶生物公司購得，農桿菌GV3101和真核表達載體pROK2由本實驗室保存提供。DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公 司，Taq酶、RNase抑 制 劑、pMD18-T載 體、T4DNA連接酶和限制性內切酶等均購自大連寶生物公司。引物合成和DNA測序由華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 NtSOC1的克隆和表達載體的構建 根據GenBank上NtSOC1序列（GB：431907）設計引物（F：5‘-CTATATTTCCTCATACCTGCAACC-3’；R：5‘-ACACATCCCAGTACAAATCATCTC-3’），RTPCR克隆序列，連接pMD18-T載體后轉化大腸桿菌DH5α。測序無誤后，連接真核表達載體pROK2（載體構建如下），轉化農桿菌GV3101。

1.2.2 農桿菌介導的轉化 農桿菌GV3101（pROK2-SOC1）在添加利福平50 mg/L、卡那霉素50 mg/L的YEB液體培養(yǎng)基中常規(guī)活化，培養(yǎng)至OD 約為0.6～0.8。將煙草無菌苗葉片的邊緣和葉脈剪去，切成1 cm×2cm大小，在準備好的農桿菌菌液中浸泡5 min。用無菌濾紙吸干植物材料表面的菌液，轉入MS固體培養(yǎng)基，葉面向下于28℃下暗培養(yǎng)，轉化空載體作為對照。3 d后將葉片轉到附加20 mg/L 利福平、300 mg/L頭孢霉素的MS分化培養(yǎng)基上，進行光照培養(yǎng)，每3周繼代培養(yǎng)1次。約1～2月后，將約2 cm高的幼苗轉到1/2 MS生根培養(yǎng)基上生根。待根系發(fā)育良好后，移栽到土壤中。

1.2.3 半定量RT-PCR 根據GenBank公布的煙草（Nicotiana tabacum）SS（AB055497）、SPSC（DQ213014）、DHAR(AY074787)、Rubisco（U35620）、SOC1（431907）、AO（D43624.1）和Actin（AB158612）的mRNA序列，設計引物用于RT-PCR擴增。RNA的提取參照Trizol試劑盒（Invitrogen）的說明書進行，反轉錄參考試劑盒（Promega）實驗步驟進行。PCR擴增后，經1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶。

1.2.4 酶活性檢測 碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase，CA）活性測定按照Hatch[7]的方法進行?？箟难徇^氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性檢測參考Vanacker[8]的方法進行檢測。

1.2.5 物質含量檢測 蔗糖含量檢測按照蔗糖檢測試劑盒（Sigma）的說明書進行。葉綠素含量檢測按照Moran[9]的方法進行?？箟难岚凑誘akahama[10]的方法進行檢測。

2 結果

2.1 NtSOC1基因的克隆

按照煙草中SOC1的已知序列在ORF框兩側設計引物，以煙草葉片cDNA為模板，RT-PCR獲得長為806 bp的清晰目標序列（圖1A），切膠回收后連接T載體，轉化大腸桿菌DH5α，挑白斑擴繁過夜后用菌液PCR的方法進行初篩（圖1B），挑選一個陽性克隆送出測序。

將測序結果（NSC）與目標序列（SOC1）比對后發(fā)現，二者之間僅有一個堿基的差異（圖2A）。預測所獲片段的氨基酸序列并與NtSOC1的氨基酸序列進行比對，發(fā)現二者序列完全一致（圖2B）。從而認為克隆到了NtSOC1的完整ORF序列。

圖1 PCR克隆和菌液PCRFig.1 Result of RT-PCR and PCR cloning

圖2 測序結果（NSC）與NtSOC1的核酸及氨基酸序列比對Fig.2 Sequence alignment between sequencing result （NSC）and NtSOC1 of nuclear acid and amino acid sequences

2.2 NtSOC1的表達載體的構建和轉化

將克隆引物加酶切位點后重新PCR，回收片段并酶切后連接真核表達載體pRoK2，轉化大腸桿菌DH5α。菌液PCR初篩后挑選陽性克隆提取質粒，BamHI和Kpn I雙酶切驗證（圖3），證明含有克隆序列的真核表達載體構建正確。提取重組質粒轉化農桿菌GV3101。

圖3 構建載體的酶切驗證Fig.3 Identification of constructed vector digested with enzymes

采用農桿菌介導的葉盤轉化法，將重組質粒pRoK2-SOC1轉化煙草，誘導成苗（圖4）。PCR檢測表明，在獲得的26棵轉基因材料中，有23棵擴增到了35S啟動子的序列和SOC1的序列，轉化率為88.46 %。形態(tài)學觀察發(fā)現，SOC1過表達導致煙草株高增加，葉片寬大，開花提前。

圖4 獲得的轉基因煙苗Fig.4 Transgenic tobacco seedlings

2.3 SOC1過表達影響葉片碳代謝和氧化還原狀態(tài)

為明確過表達SOC1造成煙株形態(tài)學改變的原因，及SOC1在葉片中的作用，初步調查了野生型煙草K326和SOC1過表達植株葉片中光合作用和糖代謝相關基因的表達水平。發(fā)現SOC1過表達不影響Rubisco大亞基、蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthetase，SPSC）和蔗糖合成酶（sucrose synthetase，SS）的表達水平，但提高了抗壞血酸氧化酶（ascorbate oxidase，AO）的表達水平（圖5）。

進一步的檢測結果表明，SOC1過表達對葉片中的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素濃度影響不大（圖6A），但光合速率（圖6B）、蔗糖含量（圖6C）和碳酸酐酶活性（圖6D）增加。意味著SOC1過表達促進了葉片中CO2的固定和蔗糖的合成。

AO定位于細胞壁，催化抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）氧化生成單脫氫抗壞血酸，而后自發(fā)歧化生成脫氫抗壞血酸（dehydroascorbate，DHA）[11]。AO表達水平的升高意味著細胞內外氧化還原狀態(tài)可能被改變，為此，檢測了葉片中的抗壞血酸含量和抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）的活性。發(fā)現與野生型煙草相比，SOC1過表達增加了葉片中的AsA含量，降低了DHA含量（圖6E）；并降低了APX活性（圖6F）；表明SOC1過表達導致葉片抗壞血酸庫趨于還原態(tài)。

圖5 野生型煙草（K326）與SOC1過表達植株（SOC1）葉片中基因表達的差異Fig.5 Different gene expression levels in leaves of wild type(K326) and SOC1 over-expression tobacco plants (SOC1)

圖6 野生型煙草（K326）與SOC1過表達植株（SOC1）葉片中光合差異Fig.6 Photosynthetic difference between wild wild type (K326) and SOC1 over-expression tobacco leaves (SOC1)

3 結論與討論

MADS-box類轉錄因子主要參與植物生殖器官的發(fā)育調控，近年來，該類轉錄因子在營養(yǎng)器官生長調控方面的作用正逐漸受到關注。將克隆的NtSOC1構建真核表達載體，由農桿菌介導轉化煙草后發(fā)現，過表達SOC1導致煙草開花提前，與Smykal等[2]獲得的結果一致。同時導致株高增加，葉片增大。為明確SOC1過表達引起形態(tài)學變化的原因，調查了轉基因和野生型煙草葉片中光合作用差異。光合作用的關鍵酶是負責碳固定的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶（Rubisco）[12]。在C3 植物中，Rubisco 活性升高提高了葉片對可溶性CO2的需求，從而影響碳酸酐酶活性。碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)催化CO2+H2O?HCO3-+H+的可逆水合反應，能提高葉片中CO2固定效率[13]。光合作用形成的葡萄糖在蔗糖磷酸合成酶（SPS）的催化下形成蔗糖，經由韌皮部裝載運往庫組織。半定量RT-PCR結果顯示，葉片中過表達SOC1不影響Rubisco大亞基的表達水平，也不影響負責合成蔗糖的蔗糖磷酸合成酶（SPSC）和負責降解蔗糖的蔗糖合成酶（SS）的表達水平（圖5）。但提高了葉片中的光合速率、碳酸酐酶活性和蔗糖含量（圖6）。表明過表達SOC1提高了葉片中的光合作用和蔗糖含量，可能與碳酸酐酶的活性增加密切相關。

碳酸酐酶的活性受細胞內氧化還原狀態(tài)的調控[14]，故而檢測了葉片中抗壞血酸相關酶的表達水平或活性變化。發(fā)現生型煙草K326相比，過表達SOC1提高了葉片中AO的表達水平，降低了APX活性，并使葉片中的還原型抗壞血酸（AsA）濃度增加，氧化性抗壞血酸（DHA）濃度降低（圖6）。AO定位于細胞壁，催化抗壞血酸與氧反應生成單脫氫抗壞血酸[15]，APX以抗壞血酸為氫供體，清除H2O2。葉片中總抗壞血酸含量的增加和APX活性的降低，意味著過表達SOC1影響了葉片中抗壞血酸庫的氧化還原狀態(tài)，使之趨于還原態(tài)。從而可能提高光合作用，促進葉片生長。

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Cloning and expression of SOC1 gene in tobacco

SHI Yongchun,YANG Yongyin,LIU Weiqun
College of Life Science,Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002,China

Open reading frame of SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANTS 1 (SOC1) gene in tobacco was cloned with full length of 806 bp to investigate its physiological function in tobacco.Agrobacterium-mediated leaf-disk transformations were used to create 26 SOC1 transgenic tobacco plants.Among which 23 were identified as positive plants with transformation rate of 88.46%.Compared with tobacco variety K326,SOC1 over-expression plants had early floral time,higher plant heights and wider and longer leaves.Semi-quantitative RT-PCR results showed that over-expression of SOC1 did not affect expression levels of Rubisco large subunit,sucrose phosphate synthetase and sucrose synthetase in leaves,but increased the level of ascorbare oxidase.It also increased carbonic anhydrase activity,concentrations of sucrose and ascorbic acid,and reduced ascorbate peroxidase activities.These results suggested that SOC1 increase carbonic anhydrase activity and photosynthesis by changing ascorbate redox state.

tobacco; SOC1; transgene; photosynthetic; ascorbic acid

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.02.017

Q78；S572.01 文獻標志碼： A 文章編號：1004-5708(2014)02-0099-05

河南省煙草公司科技項目（HYKJ201005）

石永春（1978—），副教授，主要從事煙草生理生化研究，Email：shiyongchun369@126.com

劉衛(wèi)群（1956—），博士，教授，主要從事煙草生理生化研究，Email：liuweiqun2004@126.com

2013-04-22