王 穎，伏小平*，王 棟

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州730070;2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

山羊支原體山羊肺炎亞種支原體(Mycoplasma capricomlum subspecies capricomlum，MCCP)是引起山羊傳染性胸膜肺炎的病原。目前，我國用山羊傳染性胸膜肺炎支原體強毒氣管注射山羊，采集肺組織制成山羊傳染性胸膜肺炎組織滅活疫苗，該疫苗不適宜工業(yè)化生產(chǎn)，存在散毒的危險;肺組織中雜菌含量高，所制備的疫苗易出現(xiàn)過敏反應，且安全性低等。因此，市場急需研制出一種安全、有效、適宜工業(yè)化生產(chǎn)的半合成培養(yǎng)基培養(yǎng)的山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗。菌種在經(jīng)過多年復壯、傳代后，易污染綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)，其支原體含量及遺傳穩(wěn)定性也發(fā)生變化。為了使菌種保持純凈性和良好免疫原性，對現(xiàn)有制苗用C87001株凍干肺組織菌種進行克隆研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 山羊傳染性胸膜肺炎支原體C87001株凍干肺組織，規(guī)格 1.5 g/支，1973年、1980年4月9日凍干;綿羊肺炎支原體Y－98，C4代，規(guī)格1.0 mL/支，1998年6月20日凍干;檢驗用強毒，山羊傳染性胸膜肺炎支原體強毒C87002株，代號87002，代次:52 代，規(guī)格:1.0 g/支，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應。

1.1.2 實驗動物 1歲齡山羊，健康、無傳染病、皮膚病和寄生蟲感染，應用間接血凝抑制試驗檢測綿羊肺炎支原體Y98株血清抗體為陰性，經(jīng)山羊傳染性胸膜肺炎支原體F38株及布魯氏桿菌病等血清學檢驗均為陰性。

1.1.3 支原體培養(yǎng)基制備 水解乳蛋白2.5 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖2.0 g，MEM 1.0 g，PPLO 肉湯粉17.5 g，丙酮酸鈉2.0 g，1%酚紅1.0 mL，加入少量蒸餾水中，待充分溶解后用蒸餾水定容至1000 mL，用1 mol/L NaOH調pH值至7.8左右，經(jīng)0.22 μm 過濾除菌加20%馬血清制成。

1.1.4 試劑 抗綿羊肺炎支原體血清，規(guī)格2.0 mL，瓊擴效價1∶8，凍干日期1989年2月15日，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備;細菌基因組DNA提取試劑盒(天根，DP302);Premix Ex Taq(TaKaRa，D335A);硫柳汞(德國進口);Montanide ISA 50V佐劑(SEPPIC，50873)。

1.1.5 儀器及設備 IAK 2000/4型乳化機;5804R型臺式高速冷凍離心機;pro Gradient96 PCR儀;GNP－9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱;WD－9430紫外分析儀;DYY－12型電泳儀;Dophin－Chemi凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 制苗用菌種的PCR鑒定 取山羊傳染性胸膜肺炎支原體C87001株凍干肺組織，用支原體培養(yǎng)基連續(xù)傳至7代，分別收獲1～7代培養(yǎng)物。參照試劑盒提供的方法分別提取1～7代培養(yǎng)物樣本菌液和綿羊肺炎支原體標準毒Y－98菌液的基因組 DNA。根據(jù) Woubit等［1］、Thomas等［2］建立的特異性檢測MCCP、MO的PCR方法的引物信息(表1)合成引物，對所提取基因組DNA樣本進行PCR檢測，反應體系和反應條件按照Woubit和Thomas方法，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

表1 引物信息

1.2.2 菌種的純化克?。?］用支原體培養(yǎng)基將C87001株肺組織凍干菌種(1980年)恢復原體積，取稀釋液0.2 mL加入1.8 mL含有50%抗綿羊肺炎支原體血清的EZH培養(yǎng)基中，進行10倍系列稀釋至10－10，37℃培養(yǎng)5 d。取有變色反應的最高稀釋度菌液0.2 mL，再加入1.8 mL含有50%抗綿羊肺炎支原體血清支原體培養(yǎng)基中，再進行10倍系列稀釋至10－10，37℃培養(yǎng)5 d，如此反復篩選5次，取第5次篩選試驗中有變色反應的最高稀釋度菌液進行菌落克隆試驗。

取菌液0.2 mL加入1.8 mL的支原體培養(yǎng)基中，進行10 倍系列稀釋至10－5，分別取10－3、10－4、10－53個稀釋度菌液，移植于支原體固體培養(yǎng)基平板，0.2 mL/平板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)4 ～6 d。顯微鏡下挑取細小圓形或橢圓形露滴狀透明、中央乳頭狀突起明顯、呈“煎蛋”樣的單個菌落，接種支原體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)5 d，重復克隆5次，取第5次克隆后收獲的菌液進行PCR鑒定。

1.2.3 PCR鑒定 參照試劑盒提供的方法提取1.2.2項所獲得的MCCP菌液和綿羊肺炎支原體標準株Y－98的基因組DNA［5］，分別用其特異性引物進行PCR反應，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并進行基因測序。

1.2.4 克隆株回歸實驗 將純化的C87001克隆株第5代培養(yǎng)物，按照2%接種支原體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)5 d，收獲菌液進行活菌計數(shù)，取活菌滴度≥109.0CCU/mL氣管注射健康易感山羊4只，每只羊10.0 mL，觀察30 d。

1.2.5 克隆株形態(tài)和生化特性鑒定 將1.2.2項收獲的克隆株菌液制備抹片，經(jīng)姬姆薩染色鏡檢，并對菌液進行葡萄糖發(fā)酵試驗、精氨酸試驗、尿素試驗、膜斑試驗、毛地黃皂苷試驗，鑒定克隆株生化特性。

1.2.6 克隆株培養(yǎng)特性鑒定 將純化的C87001克隆株第5代培養(yǎng)物接種支原體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)5 d，觀察培養(yǎng)特性;克隆株第5代培養(yǎng)物接種支原體培養(yǎng)基培養(yǎng)，置密閉罐中，37℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)。

1.2.7 克隆株純粹檢驗 取克隆菌株接種TG小管及支原體培養(yǎng)基斜面各2支，每支0.2 mL，1支置37℃培養(yǎng)，1支置25℃培養(yǎng)，觀察5 d。

1.2.8 克隆株免疫原性測定 按規(guī)程［6］用山羊傳染性胸膜肺炎支原體C87001克隆株，接種支原體培養(yǎng)基，收獲培養(yǎng)物適當濃縮，經(jīng)硫柳汞滅活后，加礦物油佐劑混合乳化制成疫苗。選用1歲齡健康易感山羊4只，每只肌肉注射疫苗2.0 mL。免疫后21 d攻毒，連同條件相同的對照羊3只，各氣管注射15個發(fā)病量的山羊傳染性胸膜肺炎支原體強毒C87002株組織乳劑4.0 mL。觀察30 d。

2 結果

2.1 制苗用菌種PCR鑒定結果 制苗用C87001株肺組織凍干物(1973年)，在1～3代培養(yǎng)物中同時擴增出MCCP目的基因在316 bp處的特異性條帶和MO目的基因在360 bp處的特異性條帶，4～7代培養(yǎng)物PCR檢測僅擴增出MO目的基因在360 bp處的特異性條帶(圖1、圖3);制苗用C87001株肺組織凍干物(1980年)，在1～7代培養(yǎng)物中同時擴增出MCCP目的基因在316 bp處的特異性條帶和MO目的基因在360 bp處的特異性條帶(圖2、圖4)。

圖1 1973年MCCP擴增電泳圖

圖2 1980年MCCP擴增電泳圖

圖3 1973年MO擴增電泳圖

圖4 1980年MO擴增電泳圖

2.2 山羊傳染性胸膜肺炎支原體克隆純化鑒定結果 原始菌種C87001株經(jīng)抗綿羊肺炎支原體血清反復抑制，接種支原體培養(yǎng)基長出中心呈臍狀突起、邊緣整齊的圓形菌落，符合山羊傳染性胸膜肺炎支原體的菌落形態(tài)。篩選克隆菌落純化后PCR結果中，第1、5泳道分別為純化前種毒液Pmccp，Pmo引物擴增的結果，兩條都有擴增，同時含有山羊支原體山羊肺炎亞種支原體和綿羊支原體兩種支原體病原目的基因;第2、7泳道分別為純化后種毒液Pmccp，Pmo引物擴增的結果，只有2泳道有擴增，毒種得到了純化，只含有山羊支原體山羊肺炎亞種支原體目的基因，綿羊肺炎支原體已經(jīng)得到清除;第3、6泳道為綿羊肺炎支原體兩對引物的擴增結果;第4、8泳道為空白對照，因此陽性陰性對照都成立(圖5)，PCR擴增結果可信。

圖5 純化前后菌液PCR擴增結果

2.3 序列測定結果 PCR產(chǎn)物經(jīng)英駿公司測序，測序結果與NCBI中的序列進行比對，所擴增的ArcD序列與山羊支原體山羊肺炎亞種支原體標準株F38的ArcD序列的同源性達到100%。

2.4 克隆株回歸實驗結果 氣管注射10.0 mL/只C87001克隆純化株F5代的山羊中有4/4在3～10 d體溫升至40.5℃以上稽留熱，兼有咳嗽、呼吸困難癥狀，剖檢對照組山羊肺組織呈鮮紅色(圖6)，剖檢病山羊肺組織呈大理石樣病變(圖7)。

圖6 對照組山羊肺組織

圖7 剖檢病山羊肺組織

2.5 克隆株形態(tài)和生化特性鑒定結果 克隆株經(jīng)姬姆薩染色鏡檢，菌體呈球狀、雙球狀、弧狀等典型的多形態(tài);具有代謝葡萄糖、不水解精氨酸、不分解尿素、膜斑試驗陰性、對毛地黃皂苷敏感等特性。

2.6 克隆株培養(yǎng)特性鑒定結果 將克隆株接種支原體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)5 d，呈輕度渾濁帶乳光樣纖細菌絲生長，無菌膜、沉淀或顆粒懸浮;克隆株接種支原體培養(yǎng)基培養(yǎng)，置密閉罐中，經(jīng)37℃培養(yǎng)5 d，生長出細小圓形或橢圓形露滴狀透明菌落，中央乳頭狀突起明顯，呈“煎蛋”樣。

2.7 克隆株純粹檢驗結果 結果如表2所示。

表2 克隆株菌液純粹檢驗結果

2.8 克隆株免疫原性測定結果 免疫組山羊4/4保護;對照組山羊3/3發(fā)病死亡，剖檢肺部有典型的山羊傳染性胸膜肺組織病變。

3 討論

在研制人工合成培養(yǎng)基山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗工作中，發(fā)現(xiàn)C87001株凍干肺組織傳7代中低代次保護效果高于高代次菌種;用傳至1～7代菌種制備滅活疫苗，攻毒后試驗組發(fā)病率反而高于對照組。通過對菌種PCR檢測，發(fā)現(xiàn)制苗用山羊傳染性胸膜肺炎支原體C87001株被綿羊肺炎支原體污染，開啟制苗用菌種后的1～3代培養(yǎng)物檢出山羊支原體山羊肺炎亞種和綿羊肺炎支原體兩種病原，在4～7代培養(yǎng)物中僅可以檢出綿羊肺炎支原體，既而采用抗綿羊肺炎支原體血清代謝抑制試驗、菌落克隆篩選方法對其進行純化。純化后制備滅活疫苗免疫山羊，攻毒保護為4/4(100%)，對照組3/3發(fā)病，說明克隆株毒力未丟失，且免疫原性良好。

通過人工合成培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法，生產(chǎn)的中試產(chǎn)品質量穩(wěn)定、易保存、使用方便，同時通過對山羊的預防試驗結果證實，按照該方法生產(chǎn)的疫苗安全;山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗免疫期可達12個月，達到或超過國內同類疫苗效果。生產(chǎn)工藝技術參數(shù)穩(wěn)定，適合于GMP車間工廠化生產(chǎn)。既解決了困擾疫苗生產(chǎn)的效力不足問題，又避免了肺組織疫苗不適應GMP條件生產(chǎn)、易散毒等問題，降低了疫苗生產(chǎn)成本，提高了疫苗產(chǎn)量及效力，因此對該疫苗生產(chǎn)工藝的改進、質量的提高意義重大，對山羊養(yǎng)殖業(yè)預防和控制山羊傳染性胸膜肺炎起到重要作用。

［1］ Woubit S，Lorenzon S，Peyraud A，et al.A specific PCR for the identification of Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae，the causative agent of contagious caprine pleuropneumonia(CCPP)［J］.Veterinary microbiology，2004，104:125 －132.

［2］ Besser T E，Cassirer E F，Potter K A，et al.Association of Mycoplasma ovipneumoniae infection with population－limiting respiratorydisease in free－ranging Rocky Mountain bighorn sheep(Ovis canadensis canadensis)［J］.Journal of clinical microbiology，2008，46:423－430.

［3］ 中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.SN/T2710－2012中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準［S］.

［4］ 吳移謀，葉元康.支原體學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:321.

［5］ 張明月，劉曉松，常建華，等.羊肺炎支原體基因組DNA幾種提取方法的比較［J］.內蒙古農(nóng)業(yè)大學學報，2012，33(3):9－12.

［6］ 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品規(guī)程委員會.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程2000年版［S］.