徐志勇 龍 榮 楊 勇 朱海龍 陳 曉＊

腺病毒是一種雙鏈DNA病毒，依據(jù)病毒株紅細(xì)胞凝集能力和DNA的同源性，分為六種類型，即 A、B、C、D、E、F［1-3］。其中 F型的Ad40和Ad41是引起胃腸疾病的主要腺病毒［4，5］。目前檢測腺病毒的主要方法包括病毒培養(yǎng)和血清學(xué)檢測。病毒培養(yǎng)存在細(xì)胞病變效應(yīng)和檢測時(shí)程較長，并且有的腺病毒株不能在常用培養(yǎng)細(xì)胞里復(fù)制［1］等問題；血清學(xué)檢測存在抗血清價(jià)格昂貴、分型技術(shù)繁瑣、易出現(xiàn)假陰性結(jié)果等弊端。

本研究建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測腺病毒Ad40和Ad41，并采集臨床幼兒腹瀉標(biāo)本與血清學(xué)直接免疫熒光法進(jìn)行平行檢測和對(duì)比分析，為腺病毒感染檢測提供新的有效方法。結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床標(biāo)本收集與處理

2010-09-2013-01，武漢市兒童醫(yī)院門診幼兒腹瀉標(biāo)本248例，均分成兩份，一份用于直接免疫熒光法檢測，另一份提取病毒DNA［6］，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.2.1 引物及探針：Ad40和Ad41引物及探針由上海生工生物工程有限公司合成并標(biāo)記。引物設(shè)計(jì)參考序列為 AB610527.1，上游引物：5’-TGT TYG AAG TTT TCG ACG TYG T-3’，下游引物：5’-SAG GTA GAC GGC CTC GAT GA-3’，探針序列：5’-CGCATCCACCAGCCSCACC-3’。在探針5＇端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM（6-carboxy-fluorescein），3＇端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán) TAMRA （6-carboxy–tetramethy-rhodamine）。

1.2.2 載體構(gòu)建：用 T-A 載體克隆法［7，8］，將擴(kuò)增腺病毒DNA片段克隆至pGEM-Teasy載體（中國基康生物技術(shù)公司），篩選含有插入片段的載體，用質(zhì)粒DNA提取試劑盒（QIAGEN公司）提取質(zhì)粒DNA，用紫外分光光度計(jì)定量稀釋成不同的濃度梯度 （拷貝數(shù)為101、102、103、104、105、106、107）作為制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板。

1.2.3 PCR擴(kuò)增：在50μl體系中含1×Taqman緩沖液，3.5mmol／L MgCl2，200μmol／L dATP、dCTP和 dGTP，400μmol／L dUTP，1.25UampliTaq Gold，0.5UAmp-Erase UNG，腺病毒上下游引物各0.3μmol／L，熒光探針20nmol／L，經(jīng)待測樣品提取的DNA或不同濃度的定量模板DNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件：50℃2min，95℃10min；然后95℃15s，60℃30s，共40個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由儀器自動(dòng)分析計(jì)算出待測樣品的起始拷貝數(shù)。PCR試劑盒、PCR反應(yīng)管、LightCycler PCR儀均為美國羅氏公司產(chǎn)品。所有檢測均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。每例標(biāo)本平行檢測三次取均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 直接免疫熒光法

待檢標(biāo)本涂片待干后滴加0.01mol／L pH7.4的PBS，10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度，再滴加熒光標(biāo)記的抗體溶液（10倍稀釋）（北京中生北控生物科技有限公司提供），使其完全覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫30min。取出玻片，置玻片架上，用0.01mol／L pH7.4的 PBS沖洗后，按順序用0.01mol／L pH7.4的 PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不時(shí)振蕩。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。立即用熒光顯微鏡觀察特異性熒光。

1.4 兩種檢測方法的陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測腺病毒線性范圍為1.0×103-1.0×107。最低檢測限為1.0×103，即實(shí)際工作中樣品腺病毒拷貝數(shù)＞1.0×103為腺病毒陽性。直接免疫熒光法結(jié)果判斷以標(biāo)本在熒光顯微鏡下呈綠色熒光為腺病毒陽性（圖1），否則為陰性。

圖1 直接免疫熒光法測定腺病毒的陽性結(jié)果（×400）

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件。兩種檢測方法的陽性率和方法學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)的比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR與直接免疫熒光法腺病毒陽性檢出率比較

248例幼兒腹瀉標(biāo)本中，直接免疫熒光法檢出6例腺病毒陽性，陽性檢出率為2.42%（6／248）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR除檢出直接免疫熒光法的6例陽性標(biāo)本外、還檢出直接免疫熒光法判斷為陰性的13例標(biāo)本（均已經(jīng)用限制性內(nèi)切酶法進(jìn)行鑒定并分型確認(rèn)），陽性檢出率為7.66%（19／248），明顯高于直接免疫熒光法（χ2＝3.675，P＜0.05）。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與直接免疫熒光法檢測腺病毒方法學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的靈敏度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、Kappa指數(shù)均高于直接免疫熒光法（P＜0.05），而特異度與直接免疫熒光法差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩種方法檢測腺病毒方法學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)比較

3 討 論

腸道腺病毒是一種能引起播散性腹瀉的病毒，幼兒特別容易感染，病原通常是F組腺病毒Ad40或Ad41。已報(bào)道檢測腸道腺病毒的方法有直接免疫熒光法、PCR和限制性核酸內(nèi)切酶技術(shù)及其組合檢測等［6，8］，但需要特別設(shè)備、昂貴血清及繁瑣技術(shù)等的支持。因此，建立快速、簡單、經(jīng)濟(jì)的檢測腺病毒方法，不僅有利于臨床觀察，也有助于監(jiān)測腺病毒的地區(qū)性流行情況。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測腸道腺病毒的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)引物和探針?；谀c道腺病毒Ad40和Ad41基因序列與其它型別腺病毒序列比對(duì)設(shè)計(jì)引物與探針，能確保實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性［9］，但不能區(qū)別Ad40和Ad41病毒。直接免疫熒光法是臨床實(shí)驗(yàn)室檢測腺病毒的常用方法［8］，本文比較實(shí)時(shí)熒光定量PCR與其檢測結(jié)果時(shí)發(fā)現(xiàn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR不僅能驗(yàn)證直接免疫熒光法檢測的陽性標(biāo)本，還能在直接免疫熒光法檢測為陰性的242例標(biāo)本中再檢測出13例陽性結(jié)果，表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢出率高于直接免疫熒光法。為了更進(jìn)一步證實(shí)實(shí)時(shí)熒光定量PCR診斷的正確性，作者用限制性核酸內(nèi)切酶法進(jìn)行了鑒定并分型，結(jié)果顯示19例陽性標(biāo)本為Ad40和Ad41病毒（資料待發(fā)表）。

總之，本文建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測腸道腺病毒優(yōu)于直接免疫熒光法，可為臨床診斷和治療觀察提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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