龍梓潔， 方志剛， 潘曉娜， 范蕊芳， 林東軍

慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia， CML)是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其產生的大量白細胞在骨髓內聚集，抑制骨髓的正常造血。目前，酪氨酸激酶小分子抑制劑伊馬替尼(imatinib)已經(jīng)成為治療CML的一線用藥，使得CML患者的5年生存率明顯提高，但是仍有部分患者對伊馬替尼缺乏敏感性，產生耐藥或復發(fā)［1］。因此，尋找新的有效治療方法克服CML對伊馬替尼的耐藥性成為當前迫切需要解決的問題。

myc基因編碼的蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。人類 c-myc基因定位于 8q24，c-Myc蛋白與Max蛋白形成異二聚體，異二聚體與靶基因的E-box DNA(5’-CACGTG-3’)區(qū)域結合，發(fā)揮轉錄功能，調節(jié)下游基因［2］。c-Myc蛋白參與細胞的生長、增殖、凋亡、分化、腫瘤形成及腫瘤耐藥等各個過程，并參與了多種信號通路的調控，包括 Wnt/β-catenin、phosphatidylinositol 3-kinase/Akt(PI3K/Akt)和Ras GTPase/MAP kinase(Ras/MAPK)等。在乳腺癌、前列腺癌、胃腸道腫瘤和黑色素瘤等多種實體瘤以及血液腫瘤中均發(fā)現(xiàn)c-Myc的異常表達，且與腫瘤的分期和預后相關［3］。研究報道c-Myc在白血病的發(fā)病及疾病進程中起關鍵作用［4］。鑒于c-Myc作為腫瘤治療靶點的潛在性，各研究機構紛紛致力于c-Myc小分子抑制劑的研發(fā)。其中，10058-F4在多種腫瘤如肝癌以及白血病研究中均顯現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果［5-6］。本文旨在探討c-Myc小分子抑制劑10058-F4對K562及伊馬替尼耐藥的K562/G細胞的抑制作用，從而為臨床上治療CML提供新的治療策略。

材料和方法

1 主要試劑

胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco，c-Myc小分子抑制劑10058-F4、c-Myc抗體及GAPDH抗體為Santa Cruz產品，甲磺酸伊馬替尼為Selleckchem產品，甲基纖維素為R＆D產品，其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

2 主要方法

2.1 細胞培養(yǎng) K562細胞(購自American Type Culture Collection)及伊馬替尼耐藥的K562/G細胞(由K562細胞通過逐漸增加伊馬替尼濃度培養(yǎng)篩選得到)用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗并根據(jù)實驗需要分組。

2.2 Western blotting檢測蛋白的表達水平 用細胞裂解液［20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，150 mmol/L NaCl，0.25%NP40，2.5 mmol/L sodium pyprophosphate，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L βglycerophosphate，1 mmol/L Na3VO4，1 mmol/L PMSF，1 mg/L leupeptin］提取K562及K562/G細胞總蛋白。用考馬斯亮藍法進行蛋白定量后，等量蛋白上樣，10%SDS-PAGE進行蛋白分離，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，I抗孵育，4℃過夜，HRP標記的II抗孵育1 h，于暗室中曝光。以glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)作為內參照。

2.3 MTT法檢測細胞增殖情況 K562及K562/G細胞培養(yǎng)于96孔板，分別進行不同的處理，檢測前每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，離心棄上清液后，每孔加入150 μL DMSO溶解沉淀，于490 nm波長的酶標儀測定吸光度。

2.4 流式細胞術檢測細胞周期 收集細胞后，1 500 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，后用70% 冰乙醇固定過夜，碘化丙啶 (propidium iodide，PI)染色后流式細胞儀測定細胞周期。

2.5 甲基纖維素克隆形成實驗 對照組及藥物處理組細胞(K562及K562/G)分別培養(yǎng)于甲基纖維素中，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)6 d后顯微鏡下觀察克隆。

2.6 Annexin V-PI染色檢測細胞凋亡 K562及K562/G細胞分別進行不同的處理，檢測前每孔用500 μL binding buffer 重懸，加入 5 μL Annexin VFITC及5 μL PI，避光孵育15 min后流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較分析用t檢驗或方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 伊馬替尼對K562及K562/G細胞的作用

將K562及K562/G細胞培養(yǎng)于96孔板，分別用不同劑量(0、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L)的伊馬替尼進行處理，48 h后MTT法檢測細胞的增殖情況。與對照組相比，伊馬替尼可劑量依賴性地抑制K562及K562/G細胞的增殖。K562細胞對伊馬替尼較敏感，而K562/G在同樣劑量的伊馬替尼處理下出現(xiàn)耐藥。1 μmol/L的伊馬替尼作用下，K562細胞的存活率是53.9% ±2.0%，K562/G的存活率為77.4% ±5.9%(P＜0.01)，見圖1A。Western blotting實驗結果顯示，K562/G細胞比K562細胞表達更高的c-Myc蛋白，見圖1B。

2 c-Myc抑制劑10058-F4對K562及K562/G細胞增殖及周期的影響

由于c-Myc在K562/G細胞中具有較高的表達，為了驗證c-Myc靶向抑制劑10058-F4對耐藥細胞的作用，10058-F4 以不同濃度(0、25、50、100 μmol/L)及不同時間(0、24、48、72 h)作用于K562及K562/G細胞，MTT法分析10058-F4對白血病細胞的增殖抑制作用。結果顯示:與對照組相比，10058-F4對K562及K562/G細胞均有抑制作用，且呈劑量和時間依賴性，并且對耐藥的K562/G細胞較K562細胞抑制作用更強，耐藥細胞對10058-F4更敏感，見圖2。50 μmol/L的10058-F4作用48 h，K562及K562/G細胞的存活率分別為73.3%±3.2%及63.7%±3.0%;100 μmol/L 的 10058-F4 作用 48 h，K562 及K562/G細胞的存活率分別為61.7%±3.6%及42.0%±3.2%，與對照組相比均具有顯著差異(P＜0.01)。流式細胞術檢測K562及K562/G細胞周期結果顯示，10058-F4能阻滯細胞于G0/G1期(圖3)，因此10058-F4對細胞增殖的抑制作用可能與細胞周期的阻滯相關。

Figure 2.10058-F4 inhibited proliferation of K562 and K562/G cells.A:K562 and K562/G cells were treated with various concentrations of 10058-F4 for 48 h and then subjected to MTT assay;B:K562 and K562/G cells were treated with 50 μmol/L 10058-F4 for indicated time and then subjected to MTT assay.Mean±SD.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L or 0 h.圖2 10058-F4抑制K562及K562/G細胞的增殖

3 c-Myc抑制劑10058-F4促進K562及K562/G細胞凋亡

100 μmol/L的10058-F4處理 K562及 K562/G細胞48 h后，Annexin V-PI染色并采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結果表明10058-F4可促使K562及K562/G細胞發(fā)生凋亡，見圖4。

4 c-Myc抑制劑10058-F4對K562及K562/G細胞克隆形成能力的影響

克隆形成實驗結果顯示，相對于K562細胞，K562/G細胞表現(xiàn)出更強的克隆形成能力(P＜0.01)，見圖5。伊馬替尼對于K562細胞的抑制作用明顯大于K562/G細胞(P＜0.01)，進一步表明K562/G細胞對伊馬替尼的耐藥性。10058-F4可抑制K562及 K562/G細胞的克隆形成能力，且對K562/G細胞的作用更加顯著(P＜0.01)。10058-F4與伊馬替尼聯(lián)合作用于細胞6 d后，兩藥聯(lián)用組比對照組及單藥組作用效果更加明顯，提示10058-F4可以逆轉K562/G細胞對伊馬替尼的耐藥性。

Figure 3.10058-F4 induced cell cycle arrest in K562 and K562/G cells.K562 and K562/G cells were treated with 50 μmol/L 10058-F4 for 48 h and then subjected to flow cytometry for cell cycle analysis.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control.圖3 10058-F4導致K562及K562/G細胞周期阻滯

討 論

作為腫瘤治療的潛在靶點，c-Myc在人類多種實體腫瘤及血液腫瘤中異常高表達。研究報道，c-Myc的異常表達可促進腫瘤的形成和進展［7］;抑制c-Myc的表達可抑制腫瘤細胞生長，促進細胞凋亡、衰老和分化。更重要的是，c-Myc的高表達在白血病發(fā)生過程中起關鍵的作用［8］，抑制c-Myc能夠阻止白血病的發(fā)生［9］。c-Myc通過調節(jié)一系列下游基因決定細胞的存活。c-Myc在CML患者的CD34+造血前體細胞中通過調控ATP-binding cassette(ABC)轉運蛋白的基因轉錄從而導致細胞對化療藥物的耐藥［10］。另外，c-Myc可調節(jié)多種micro RNA，包括增加促進腫瘤發(fā)生的microRNA及降低腫瘤抑制作用的micro-RNA的表達。在K562細胞中，c-Myc可通過調控miR-144/451的表達使K562細胞獲得對伊馬替尼的抗藥性［11］。

Figure 4.10058-F4 induced apoptosis of K562 and K562/G cells.K562 and K562/G cells were treated with 100 μmol/L 10058-F4 for 48 h and then subjected to flow cytometry for Annexin V-PI analysis.Mean±SD.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs control.圖4 10058-F4促進K562及K562/G細胞發(fā)生凋亡

本研究發(fā)現(xiàn)c-Myc表達上調是耐藥細胞克隆形成能力增強的細胞遺傳學特征之一，c-Myc的高表達可能導致K562/G細胞對于伊馬替尼的敏感性降低。c-Myc抑制劑10058-F4可抑制K562及K562/G細胞的增殖，并且對K562/G細胞表現(xiàn)出更強的殺傷作用，可能與其高表達c-Myc相關。細胞周期檢測顯示10058-F4能阻滯細胞于G0/G1期，因此10058-F4抑制細胞增殖可能與細胞周期阻滯相關，與之前的研究結果一致［6］。同時，10058-F4可促進K562及K562/G細胞發(fā)生凋亡。此外，細胞克隆形成實驗顯示，K562/G細胞對10058-F4具有更高的敏感性。在肝癌［5］、肺癌［12］及黑色素瘤［13］的研究中，抑制 c-Myc的表達可增強細胞對化療藥物的敏感性。我們的研究發(fā)現(xiàn)10058-F4可恢復耐藥K562/G細胞對于伊馬替尼的敏感性，減少細胞的克隆形成數(shù)目。因此，高表達c-Myc的K562/G細胞可能通過上調c-Myc的表達增強對伊馬替尼的抵抗作用，提高細胞的耐藥性。10058-F4作為一個有效的c-Myc的小分子抑制劑，可殺傷白血病細胞，逆轉耐藥。

Figure 5.10058-F4 supressed colony formation of K562 and K562/G cells.K562 and K562/G cells were treated with 50 μmol/L 10058-F4 or/and 1 μmol/L imatinib for 6 d and subjected to colony formation analysis(×100).＊＊P＜0.01 vs K562;##P＜0.01 vs imatinib.圖5 10058-F4抑制K562及K562/G細胞的克隆形成能力

本實驗初步分析了c-Myc對CML耐藥細胞特性的影響。結果表明c-Myc在CML細胞耐藥性中起重要作用，c-Myc的小分子抑制劑可有效殺傷K562細胞及伊馬替尼耐藥的K562/G細胞，預示通過抑制c-Myc的表達可以克服CML治療過程中的耐藥問題，為臨床提供新的治療策略。

［1］ Kantarjian HM，Talpaz M，Giles F，et al.New insights into the pathophysiology of chronic myeloid leukemia and imatinib resistance［J］.Ann Intern Med，2006，145(12):913-923.

［2］ Dang CV，O′Donnell KA，Zeller KI，et al.The c-Myc target gene network［J］.Semin Cancer Biol，2006，16(4):253-264.

［3］ Nesbit CE，Tersak JM，Prochownik EV.MYC oncogenes and human neoplastic disease［J］.Oncogene，1999，18(19):3004-3016.

［4］ Hoffman B，Amanullah A，Shafarenko M，et al.The proto-oncogene c-myc in hematopoietic development and leukemogenesis［J］.Oncogene，2002，21(21):3414-3421.

［5］ Lin CP，Liu JD，Chow JM，et al.Small-molecule c-Myc inhibitor，10058-F4，inhibits proliferation，downregulates human telomerase reverse transcriptase and enhances chemosensitivity in human hepatocellular carcinoma cells［J］.Anticancer Drugs，2007，18(2):161-170.

［6］ Huang MJ，Cheng YC，Liu CR，et al.A small-molecule c-Myc inhibitor，10058-F4，induces cell-cycle arrest，apoptosis，and myeloid differentiation of human acute myeloid leukemia［J］.Exp Hematol，2006，34(11):1480-1489.

［7］ 潘曉娜，方志剛，龍梓潔，等.上調c-myc基因的表達對U937白血病細胞的影響［J］.中國病理生理雜志，2013，29(11):1984-1989.

［8］ Delgado MD，Albajar M，Gomez-Casares MT，et al.MYC oncogene in myeloid neoplasias［J］.Clin Transl Oncol，2013，15(2):87-94.

［9］ Roderick JE，Tesell J，Shultz LD，et al.c-Myc inhibition prevents leukemia initiation in mice and impairs the growth of relapsed and induction failure pediatric T-ALL cells［J］.Blood，2014，123(7):1040-1050.

［10］ Porro A，Iraci N，Soverini S，et al.c-MYC oncoprotein dictates transcriptional profiles of ATP-binding cassette transporter genes in chronic myelogenous leukemia CD34+hematopoietic progenitor cells［J］.Mol Cancer Res，2011，9(8):1054-1066.

［11］ Liu L，Wang S，Chen R，et al.Myc induced miR-144/451 contributes to the acquired imatinib resistance in chronic myelogenous leukemia cell K562［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，425(2):368-373.

［12］ Knapp DC，Mata JE，Reddy MT，et al.Resistance to chemotherapeutic drugs overcome by c-Myc inhibition in a Lewis lung carcinoma murine model［J］.Anticancer Drugs，2003，14(1):39-47.

［13］ Citro G，D′Agnano I，Leonetti C，et al.c-myc antisense oligodeoxynucleotides enhance the efficacy of cisplatin in melanoma chemotherapy in vitro and in nude mice［J］.Cancer Res，1998，58(2):283-289.