辛 毅， 李 娜， 張 穎， 黃益民， 劉 颯， 許秀芳， 張兆光

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠是將來(lái)源于維多利亞多管水母(Aequorea victoria)的發(fā)光蛋白通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)敲入C57小鼠基因序列中獲得的組織細(xì)胞發(fā)出綠色熒光的小鼠，其細(xì)胞自發(fā)熒光的特點(diǎn)為干細(xì)胞示蹤提供了良好的動(dòng)物來(lái)源［1-2］。目前對(duì)GFP轉(zhuǎn)基因小鼠臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)的純化培養(yǎng)未見報(bào)道，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的分離培養(yǎng)報(bào)道也較少。MSCs具有多向分化潛能，在體外適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下可以分化為骨、脂肪、內(nèi)皮、軟骨、肌肉和神經(jīng)等多種組織細(xì)胞，體外培養(yǎng)不丟失其多向分化潛能，GFP小鼠作為良好的示蹤工具提供了一個(gè)很好的細(xì)胞來(lái)源［3］。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)酶消化法培養(yǎng)UCMSCs與密度梯度離心法分離BMSCs，在生物學(xué)特性、表面標(biāo)志及多向分化潛能等方面進(jìn)行比較，為干細(xì)胞示蹤提供了良好的細(xì)胞來(lái)源及技術(shù)方法。

材料和方法

1 動(dòng)物

孕晚期健康GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，體質(zhì)量50～55 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，北京市心肺血管疾病研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖。

2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素和鏈霉素均為Gibco產(chǎn)品。Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶均為Sigma產(chǎn)品。MTT為Promega產(chǎn)品。成骨和成脂誘導(dǎo)試劑盒(Mesenchymal Adipogenesis Kit和Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis Kit)為Millipore產(chǎn)品。小鼠淋巴細(xì)胞分離液為國(guó)產(chǎn)試劑。流式抗體 PE-CD90、PE-CD105、PE-CD44、PE-CD45、PE-CD79a、PE-CD19 和 PE-CD14 為 BD 產(chǎn)品;細(xì)胞培養(yǎng)板、離心管和培養(yǎng)皿等均為Corning產(chǎn)品。4000B型熒光倒置顯微鏡為L(zhǎng)eica產(chǎn)品。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Electron產(chǎn)品)。酶標(biāo)檢測(cè)儀(Beckman產(chǎn)品)。超凈工作臺(tái)購(gòu)自北京昌平長(zhǎng)城凈化空氣儀器廠，TGL-16C離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠。

3 方法

3.1 取材 用0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉孕鼠，75%乙醇消毒腹部，將子宮取出并分離胚胎，剪取臍帶組織，置含雙抗預(yù)冷0.01 mmol/L PBS的培養(yǎng)皿中清洗3次，去除血污抗菌，將臍帶用眼科剪剪碎成約1 mm×1 mm×1 mm組織塊，放入50 mL離心管中備用;再用消毒的手術(shù)器械無(wú)菌分離四肢長(zhǎng)骨，去除骨膜及殘留肌肉，剪去長(zhǎng)骨兩端，暴露髓腔后放入100 mm培養(yǎng)皿中備用。

3.2 Ⅱ型膠原酶消化分離UCMSCs 將臍帶組織碎塊放入50 mL離心管，再加入2 g/LⅡ型膠原酶，體積為組織的15～20倍為宜。37℃、100 r/min水浴搖床消化60～90 min，吸管輕輕吹打組織塊1～2 min，當(dāng)臍帶組織塊由白色呈半透明狀態(tài)時(shí)，用10%FBS DMEM/F12終止消化，收獲細(xì)胞;在其余未完全消化的組織塊中再次加入消化液，是上一次消化液總體積的1/2，消化時(shí)間為60 min，余步驟同前;重復(fù)消化2～3次，所有的細(xì)胞懸液均過(guò)200目銅網(wǎng)純化。細(xì)胞懸液1 000 r/min離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀中加含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基2 mL，將細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶，再補(bǔ)充3 mL含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，置體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d換液1次。

3.3 密度梯度離心法分離BMSCs 用注射器吸取DMEM/F12培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集沖洗液，1 200 r/min離心10 min，棄上清。用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基吹打重懸細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，緩緩加入到15 mL裝有小鼠淋巴細(xì)胞分離液離心管中，使細(xì)胞懸液位于分離液之上，2 500 r/min離心20 min后取出離心管，管中液體分為4層，從上至下為培養(yǎng)基層、單個(gè)核細(xì)胞層、分離液層及沉淀的紅細(xì)胞，用無(wú)菌吸頭吸取單個(gè)核細(xì)胞層置于新的離心管，加入 DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，1 200 r/min離心10 min，棄上清。計(jì)數(shù)后以1×1010/L密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，標(biāo)記為P0，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后全量換液，以后每2～3 d換液，棄去未貼壁細(xì)胞以達(dá)到純化的目的。

3.4 UCMSCs及BMSCs生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 分別取2種原代細(xì)胞，按2×107/L接種于24孔培養(yǎng)板，每孔接種1 mL。從接種時(shí)間算起，每隔24 h計(jì)數(shù)5孔內(nèi)的細(xì)胞密度，算出平均值，共計(jì)7 d。以培養(yǎng)時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)、細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

3.5 MST法測(cè)定UCMSCs及BMSCs增殖 分別取2種原代細(xì)胞，以每孔約2×104個(gè)細(xì)胞等量接種于96孔板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)液，置體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。每隔1 d向其中5孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，孵育4 h后，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度 (A490)，每天測(cè)5孔，連續(xù)測(cè)7 d。設(shè)立平行對(duì)照孔調(diào)零。

3.6 UCMSCs及BMSCs傳代及純化 細(xì)胞生長(zhǎng)成致密單層后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，待大部分細(xì)胞變圓時(shí)，加含100 mL/L FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)輕輕吹打，1∶3傳代;依次標(biāo)記為P1、P2 和 P3。

3.7 UCMSCs及BMSCs周期的測(cè)定 分別取P3達(dá)到80% ～90%融合細(xì)胞，消化、洗滌并計(jì)數(shù)2×108/L，700 mL/L冰乙醇固定24 h后，PBS洗滌2次，加 200 μL RNase A(1 g/L)，37 ℃水浴 30 min，再加 PI染色液(50 mg/L)避光反應(yīng) 30 min，BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Multicycle軟件分析。

3.8 UCMSCs及BMSCs流式細(xì)胞術(shù)分析 分別取P3細(xì)胞，胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌2次，分別加入標(biāo)志物 PE-CD90、PE-CD105、PE-CD44、PE-CD45、PE-CD14、PE-CD79a和 PE-CD19 流式抗體，同時(shí)做同型對(duì)照，4℃孵育30 min，PBS洗去未標(biāo)記的抗體，20 g/L多聚甲醛固定后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

3.9 UCMSCs及BMSCs誘導(dǎo)分化潛能的檢測(cè)

3.9.1 UCMSCs及BMSCs成脂的誘導(dǎo) 分別取P3細(xì)胞，以2×105個(gè)接種于6孔板，體外向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化:含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)至100%融合，換為成脂分化誘導(dǎo)液(10%FBS的DMEM/F12，10 mg/L 胰島素，1 μmol/L 地塞米松，0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基黃嘌呤，100 μmol/L 吲哚美辛，1×105U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素)，連續(xù)誘導(dǎo)30 d后，PBS洗2次，油紅O染液染色30 min，蒸餾水沖洗至背景干凈，蘇木素復(fù)染10 min，自來(lái)水沖洗3次，在顯微鏡下取圖，并統(tǒng)計(jì)油紅O染色的陽(yáng)性細(xì)胞。陰性對(duì)照組用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3～4 d換1次液，連續(xù)誘導(dǎo)30 d后，后續(xù)處理與誘導(dǎo)組同時(shí)進(jìn)行并觀察統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)。

3.9.2 UCMSCs及BMSCs成骨的誘導(dǎo) 分別取 P3細(xì)胞，以2×105個(gè)接種于6孔板，體外向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化:含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)至80%融合，棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，換成成骨分化誘導(dǎo)液(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清，100 nmol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，0.2 mmol/L 抗壞血酸，1×105U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素)，連續(xù)誘導(dǎo)14 d，在顯微鏡下觀察可見細(xì)胞不透明區(qū)域時(shí)，PBS洗2次，700 mL/L冰乙醇固定1 h，PBS洗2次，用茜素紅染料1 mL滴加于每孔中，染色20 min后，用PBS洗2次，在倒置顯微鏡下觀察，并統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。陰性對(duì)照組用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3～4 d換1次液，連續(xù)培養(yǎng)14 d后，后續(xù)染色步驟與誘導(dǎo)組相同并觀察統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 酶消化法分離培養(yǎng)UCMSCs

用Ⅱ型膠原酶消化臍帶組織塊，可以得到較多的單個(gè)游離細(xì)胞，接種到培養(yǎng)皿里，24 h后可貼壁，1 d后形狀由圓形逐漸變成長(zhǎng)梭形，見圖1A;2 d后細(xì)胞已開始生長(zhǎng)，向四周伸展，呈旋渦狀生長(zhǎng)，見圖1B;4 d后貼壁的細(xì)胞由中心向周圍不斷生長(zhǎng)，細(xì)胞排列成復(fù)層，細(xì)胞生長(zhǎng)形狀變得不規(guī)則，相互之間緊密相連，鋪滿平皿底部就可傳代，見圖1C。

Figure 1.Primary culture of UCMSCs by enzyme digestion method(×100).A:1 d;B:2 d;C:4 d.圖1 酶消化法原代培養(yǎng)的UCMSCs

2 密度梯度離心法分離BMSCs

用密度梯度離心法分離BMSCs，可以得到較多的單個(gè)游離細(xì)胞，接種到培養(yǎng)皿里，24 h后可貼壁，細(xì)胞兩端伸出突起，見圖2A，細(xì)胞射光性較強(qiáng);2 d后形狀由長(zhǎng)橢圓形逐漸變成短梭形，由中心向四周不斷生長(zhǎng)，見圖2B，呈克隆樣生長(zhǎng);4 d后細(xì)胞大量生長(zhǎng)，呈集聚性長(zhǎng)梭形伸展的細(xì)胞，排列成單層，細(xì)胞生長(zhǎng)形狀變得規(guī)則，相互之間緊密相連，鋪滿平皿底部就可傳代，見圖2C。

Figure 2.Primary culture of BMSCs by density gradient separation method(×100).A:1 d;B:2 d;C:4 d.圖2 密度梯度分離法原代培養(yǎng)的BMSCs

3 原代培養(yǎng)UCMSCs及BMSCs生長(zhǎng)曲線

比較連續(xù)7 d測(cè)定的生長(zhǎng)曲線顯示:原代培養(yǎng)的UCMSCs接種0～1 d后，細(xì)胞數(shù)明顯增加，比BMSCs數(shù)目增多，差異顯著(P＜0.05);2～5 d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞數(shù)在此段時(shí)間內(nèi)達(dá)到高峰，比BMSCs數(shù)目增多，差異顯著(P＜0.01);5 d后細(xì)胞數(shù)量減少，但細(xì)胞數(shù)仍比BMSCs略多，差異顯著(P＜0.01);細(xì)胞呈現(xiàn)“潛伏期－對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期－平臺(tái)期”的生長(zhǎng)模式，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線近似“S”形;原代培養(yǎng)的BMSCs接種0～4 d后，細(xì)胞數(shù)緩慢增加，5～7 d后細(xì)胞數(shù)也有增加趨勢(shì)，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線平緩，未顯示出“S”形特征，見圖3。

4 原代培養(yǎng)UCMSCs及BMSCs MTT測(cè)定結(jié)果

原代培養(yǎng)UCMSCs增殖能力測(cè)定，連續(xù)7 d測(cè)定A490值。UCMSCs生長(zhǎng)前2 d與第3天比較有顯著差異(P＜0.05)，提示增殖能力較弱;3～5 d變化較為顯著，提示此段時(shí)間內(nèi)細(xì)胞增殖較快，可進(jìn)行傳代;原代培養(yǎng)BMSCs增殖能力的測(cè)定，接種細(xì)胞后1～4 d，細(xì)胞數(shù)目無(wú)明顯變化(P＞0.05)，提示此階段增殖能力較弱，5～7 d細(xì)胞數(shù)目變化較明顯，前4 d與第5～7天比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示此段時(shí)間內(nèi)細(xì)胞增殖較快，7 d后可進(jìn)行傳代。原代培養(yǎng)UCMSCs與BMSCs增殖能力相比較有顯著差異(P＜0.05)，見表1。

Figure 3.The growth curves of primarily cultured UCMSCs and BMSCs.Mean ± SD.n=5.*P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs BMSCs.圖3 原代培養(yǎng)UCMSCs及BMSCs生長(zhǎng)曲線

表1 原代培養(yǎng)UCMSCs及BMSCs細(xì)胞活力測(cè)定Table 1.Viability of primary culture of UCMSCs and BMSCs(Mean±SD.n=5)

5U CMSCs及BMSCs傳代及純化特點(diǎn)

2種方法培養(yǎng)的細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%即可傳代，2.5 g/L胰蛋白酶消化后，細(xì)胞呈單個(gè)，亮而圓，1 d后，細(xì)胞貼壁，單層生長(zhǎng)，呈散在的長(zhǎng)梭形，3d后細(xì)胞呈密集單層生長(zhǎng)，有細(xì)胞集落出現(xiàn)，融合率達(dá)80%左右，可形成致密的單層;細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，從細(xì)胞開始生長(zhǎng)3～5 d傳代1次。UCMSCs與BMSCs計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，即細(xì)胞的成活率約為97%，表明培養(yǎng)的細(xì)胞消化傳代成活率高，見圖4。2種細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

Figure 4.Morphologic changes of UCMSCs(A)and BMSCs(B)in the third passage(fluorescence microscope，×100).圖4P3 UCMSCs及BMSCs形態(tài)特征

6U CMSCs及BMSCs周期分析

流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)P3 UCMSCs和BMSCs的G0/G1和S+G2/M百分率，結(jié)果顯示，UCMSCs G0/G1期細(xì)胞占85.95%，顯著高于S期與G2/M期細(xì)胞之和，見圖5A;BMSCs G0/G1期細(xì)胞占87.92%，顯著高于S期與G2/M期細(xì)胞之和，見圖5B。2種細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

7 UCMSCs及BMSCs免疫表型流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

P3 UCMSCs PE-CD44、PE-CD105和 PE-CD90陽(yáng)性表達(dá)率為(65.40 ±1.43)%、(58.90 ±1.67)%和(64.50 ±1.96)%，而 PE-CD79a、PE-CD19、PE-CD14和PE-CD45表達(dá)率低，陽(yáng)性率分別為(12.70±0.45)%、(39.40 ± 0.34)%、(3.40 ± 0.54)%、(31.50 ±0.26)%，見圖 6A;P3 BMSCs PE-CD44、PE-CD105和PE-CD90高表達(dá)，為(55.30±1.29)%、(61.90 ± 1.76)% 和(57.90 ± 1.96)%，而 PECD79a、PE-CD19、PE-CD14 和 PE-CD45表達(dá)率低，分別為(10.90% ±0.64)%、(27.70 ±2.19)% 、(20.60±0.84)%和(25.90±0.84)%，見圖6B;2種細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

Figure 5.Cell cycle analysis of UCMSCs(A)and BMSCs(B)in third passages.圖5P3代UCMSCs及BMSCs DNA周期分析

8U CMSCs及BMSCs成脂細(xì)胞誘導(dǎo)

P3 UCMSCs和BMSCs分別成脂誘導(dǎo)20 d左右，細(xì)胞形態(tài)逐漸由長(zhǎng)梭形變?yōu)槎趟笮?，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，高倍鏡下可見細(xì)胞變?yōu)闄E圓形或圓形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有顆粒樣物質(zhì)，胞質(zhì)較多，核較大，空泡，提示脂滴開始形成。隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，胞質(zhì)內(nèi)的脂滴增多。誘導(dǎo)后的細(xì)胞經(jīng)油紅O染色，可見胞質(zhì)中有大量被染成紅色的脂滴，UCMSCs油紅O染色呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為(94.6±3.8)%，見圖 7A;BMSCs陽(yáng)性率為(30.5±2.6)%，見圖7B。2種細(xì)胞的陽(yáng)性率有顯著差異(P＜0.05)。對(duì)照組 P3 UCMSCs和 BMSCs用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d后，在顯微鏡下觀察未見細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，油紅O染色均未見胞質(zhì)中紅色的脂滴，即油紅O染色陰性，見圖7C、D。

Figure 6.Flow cytometry analytic results of cellular surface antigens of UCMSCs(A)and BMSCs(B)in the third passage.圖6 P3 UCMSCs及BMSCs細(xì)胞免疫表型分析

Figure 7.Adipogenic differentiation of UCMSCs and BMSCs in the third passage(Oil red O staining，× 400).A:UCMSCs(induction group);B:BMSCs(induction group);C:UCMSCs(control group);D:BMSCs(control group).圖7 P3 UCMSCs及BMSCs成脂細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)果

9U CMSCs及BMSCs成骨細(xì)胞誘導(dǎo)

P3 UCMSCs及BMSCs分別成骨誘導(dǎo)15 d左右，細(xì)胞形態(tài)逐漸由長(zhǎng)梭形變?yōu)轺[片形、三角形或多角形等，細(xì)胞外基質(zhì)分泌增多，中央可見類似結(jié)節(jié)狀的結(jié)構(gòu)，部分細(xì)胞呈現(xiàn)層疊狀生長(zhǎng)，茜紅素染色后可見細(xì)胞密集處有紅色的沉著物，呈團(tuán)狀并向四周放射狀排列，中心顏色明顯加深。UCMSCs茜紅素染色陽(yáng)性率達(dá)(92.5±5.1)%，見圖 8A;BMSCs陽(yáng)性率為(35.5±3.4)%，見圖8B。2種細(xì)胞的陽(yáng)性率有顯著差異(P＜0.05)。對(duì)照組 P3 UCMSCs和 BMSCs用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d后，在顯微鏡下觀察未見細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，茜素紅染色均未見紅色的結(jié)節(jié)狀細(xì)胞團(tuán)，即茜素紅染色陰性，見圖8C、D。

Figure 8.Osteogenic differentiation of UCMSCs and BMSCs in the third passage(Alizarin red staining，×100).A:UCMSCs(induction group);B:BMSCs(induction group);C:UCMSCs(control group);D:BMSCs(control group).圖8 P3 UCMSCs和BMSCs成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)果

討 論

熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)是近年來(lái)高速發(fā)展的一種細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)，采用基因嵌合的方式將熒光蛋白基因嵌合入待標(biāo)記的細(xì)胞。GFP基因是研究活細(xì)胞中基因表達(dá)和定位的新型報(bào)告基因，被廣泛應(yīng)用于移植干細(xì)胞的體內(nèi)示蹤，但其細(xì)胞標(biāo)記的時(shí)效性極不穩(wěn)定，熒光容易淬滅［4］。而熒光蛋白轉(zhuǎn)基因動(dòng)物則不存在標(biāo)記不穩(wěn)定的缺陷，細(xì)胞體外擴(kuò)增傳代和體內(nèi)分化均不會(huì)引起熒光強(qiáng)度減弱或淬滅，可以提供熒光穩(wěn)定、獲取簡(jiǎn)便的示蹤細(xì)胞［5-6］。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)于BMSCs分離純化和培養(yǎng)的研究中，采用GFP轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行研究的比較少，在GFP小鼠臍帶中分離MSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)的技術(shù)方法未見報(bào)道。有研究表明，臍帶中富含干細(xì)胞，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于骨髓中的含量，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞有望取代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成為組織工程中更為理想的種子細(xì)胞［7］。本研究利用GFP轉(zhuǎn)基因小鼠作為細(xì)胞供體，采用酶消化法消化臍帶組織的方式獲得數(shù)量充足的UCMSCs，且操作簡(jiǎn)單易行，可更好地保持細(xì)胞活力，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形旋渦狀生長(zhǎng)且增殖能力較強(qiáng)，3 d后即可傳代，細(xì)胞在短期內(nèi)增殖迅速，縮短了原代培養(yǎng)時(shí)間。BMSCs可以通過(guò)貼壁細(xì)胞分離法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分選法和免疫磁珠分離法進(jìn)行分離［8］，本研究利用密度梯度離心法分離BMSCs，操作較復(fù)雜，能夠獲取較均一的單個(gè)核細(xì)胞但細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞貼壁慢，呈成纖維狀克隆樣生長(zhǎng)，原代培養(yǎng)7 d后才能傳代，傳代培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)。臍帶MSCs與骨髓MSCs相比較，分離細(xì)胞操作簡(jiǎn)單且數(shù)量多;原代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁時(shí)間快，所用時(shí)間短，短期內(nèi)迅速增殖，臍帶源MSCs可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供充足的細(xì)胞。

為了更加深入地比較2種源性干細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖特性，本研究采用生長(zhǎng)曲線法、MTT法和DNA周期檢測(cè)細(xì)胞生物學(xué)特性，其結(jié)果顯示:原代培養(yǎng)的UCMSCs在3～5 d生長(zhǎng)迅速，即可傳代;BMSCs于8 d后迅速增殖且可以傳代，細(xì)胞增殖生長(zhǎng)曲線與MTT結(jié)果相一致。UCMSCs與BMSCs比較，UCMSCs原代培養(yǎng)所需時(shí)間較短，在短期內(nèi)可獲得數(shù)量較多的細(xì)胞，為基礎(chǔ)研究提供充足的靶細(xì)胞。通過(guò)對(duì)第3代UCMSCs、BMSCs經(jīng)DNA周期檢測(cè)法分析，其結(jié)果顯示，85%的細(xì)胞處于G0/G1期，只有接近15%的細(xì)胞處于 S+G2/M期，符合干細(xì)胞生長(zhǎng)特性［9］。從DNA周期結(jié)果可以得出，2種源性的MSCs傳代后增殖潛力基本一致，具有典型干細(xì)胞增殖特點(diǎn)，將對(duì)深入了解細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育有重要意義。

目前尚未明確MSCs的特異性抗原標(biāo)志，不同的實(shí)驗(yàn)室分離和擴(kuò)增MSCs的條件差異很大，通常以細(xì)胞形態(tài)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果和多向分化潛能作為判斷標(biāo)準(zhǔn)［10］，對(duì)細(xì)胞的分子免疫表型、分化潛能及功能的鑒定亦有不同，有一些比較公認(rèn)的表面分子標(biāo)志，包括 CD29、CD73、CD90、CD105、CD44 等，同時(shí)不表達(dá)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志，包括 CD14、CD45、CD11b、CD34 等［11］，本研究對(duì)第 3 代 UCMSCs及BMSCs經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志CD105、CD90和 CD44，而低表達(dá)血源性標(biāo)志物CD45、CD19、巨噬細(xì)胞表面分化抗原CD14及B細(xì)胞表面抗原CD79a，2種源性細(xì)胞無(wú)明顯差異。

為驗(yàn)證GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的UCMSCs及BMSCs的多向分化潛能，在不同培養(yǎng)條件下，本研究采用成脂及成骨誘導(dǎo)試劑盒對(duì)第3代細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)。結(jié)果表明:UCMSCs和BMSCs經(jīng)成脂及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，通過(guò)油紅O染色證實(shí)分化為脂肪細(xì)胞，經(jīng)茜紅素染色證實(shí)分化為成骨細(xì)胞。臍帶MSCs向脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞分化潛能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于骨髓MSCs，臍帶MSCs將更有利于干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用。

綜上所述，本研究建立了GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的UCMSCs和BMSC原代培養(yǎng)方法，通過(guò)對(duì)2種源性細(xì)胞進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)、生長(zhǎng)增殖特性、細(xì)胞表型鑒定、誘導(dǎo)分化潛能等的生物學(xué)特性的對(duì)比研究，證實(shí)UCMSCs可作為一種方便、高效的示蹤干細(xì)胞，為研究干細(xì)胞龕調(diào)控機(jī)制打下良好的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

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