李佳縈， 馮 烈

傳統(tǒng)的降糖藥物無法阻止胰島β細胞的進行性衰竭。干細胞技術的發(fā)展有望解決這一難題。體外骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)分化為胰島素分泌細胞是目前的研究熱點。大量動物實驗利用不同的培養(yǎng)方法充分證明了此種定向分化的可行性。然而，這些方法一般所需的周期較長，有的甚至達數(shù)月之久。本研究旨在嘗試一種新的培養(yǎng)方法，有望在10 d內成功誘導BMSCs定向分化，并且探討這種新型誘導劑——曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)的適宜濃度，希望為此領域的研究提供一個方便快捷、值得推廣的方法。

材料和方法

1 細胞和試劑

C57BL/6小鼠骨髓間充質干細胞系購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司，干細胞完全培養(yǎng)基購自Gibco，曲古抑菌素A和雙硫腙購自Sigma，胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)購自杭州中肽生化有限公司，細胞級二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自 Sigma，DMEM/F12 培養(yǎng)基購自M＆C，兔抗人胰島素抗體購自Santa Cruz，山羊抗兔Ⅱ抗購自Invitrogene，胰島素ELISA試劑盒購自廣州外顯子生物科技有限公司。

2 實驗分組

實驗分為5組:對照組(DMSO，A組)和干預組(25 nmol/L，B組;50 nmol/L，C組;100 nmol/L，D組;200 nmol/L，E 組)。

3 方法

3.1 細胞培養(yǎng) C57BL/6小鼠骨髓間充質干細胞系培養(yǎng)于C57BL/6小鼠骨髓間充質干細胞完全培養(yǎng)基中(低糖DMEM，含10%胎牛血清、10 mmol/L HEPES、1×105U/L青霉素和100 mg/L的鏈霉素)，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇生長良好的細胞鋪進25 cm2細胞培養(yǎng)瓶，80% ～90%時進行傳代，分別用無酚紅、無血清的DMEM培養(yǎng)基預處理，即37℃、5%CO2中培養(yǎng)6 h，使其處于同步化狀態(tài)，根據(jù)實驗要求稀釋3×105細胞懸液加入鋪有玻片的6孔板中培養(yǎng)，每24 h換液1次，共3 d。然后進行實驗分組，加入TSA進行誘導處理，3 d后洗脫TSA，加入含GLP-1的高糖培養(yǎng)基7 d后檢測各項指標。

3.2 雙硫腙染色鑒定胰島素分泌細胞 加入含GLP-1的高糖培養(yǎng)基7 d后進行雙硫腙染色，50 mg雙硫腙溶解在5 mL DMSO中，磁場攪拌30 min，0.2 μm過濾器過濾分裝，-20℃避光保存。使用時將10 μL雙硫腙冷溶液加入1 mL GLP-1培養(yǎng)液中，37℃細胞培養(yǎng)30 min，PBS洗3遍，倒置相差顯微鏡下觀察胰島樣細胞。每張片選取5個視野，使用上海捷達圖像分析系統(tǒng)，根據(jù)免疫組化的結果計算胰島素染色陽性面積、陽性率(胰島素染色陽性面積/細胞總面積)，代表胰島素分泌細胞的量，計算胰島素染色積分吸光度(平均吸光度×胰島素染色陽性面積)代表胰島素表達總量。

3.3 免疫熒光染色鑒定胰島素分泌表達 待檢細胞首先用未標記的兔抗人胰島素抗體(Ⅰ抗)處理，使之與特異的抗原(胰島素)形成復合物，然后再用熒光藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標記的山羊抗兔抗體(Ⅱ抗)著色，即可檢測出胰島素在細胞中的存在部位，以 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI)作為對比劑。熒光顯微鏡下觀察。以488 nm波長的激發(fā)光激發(fā)，對各樣本進行掃描。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對獲得的圖像進行熒光強度分析，取其平均熒光值作為定量參數(shù)。

3.4 ELISA測定胰島素含量 采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定樣品中小鼠胰島素的水平。向預先包被了小鼠胰島素單克隆抗體的酶標孔中加入胰島素，溫育;溫育后加入生物素標記的抗胰島素抗體，再與鏈霉親和素-HRP結合，形成免疫復合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色，顏色的深淺與樣品中小鼠胰島素的濃度成正比。以空白調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(A)。根據(jù)標準品的濃度及對應的A值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的A值在回歸方程上計算出對應樣品的胰島素含量。

4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，不符合正態(tài)分布者經(jīng)自然對數(shù)校正后進行分析，計量資料的多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 細胞形態(tài)觀察

生長良好的C57BL/6小鼠骨髓間充質干細胞應用倒置相差顯微鏡觀察其形態(tài)，各個實驗組間細胞形態(tài)上無明顯差異，呈典型的長梭形樣外觀，極性排列，細胞輪廓清楚，見圖1。經(jīng)過TSA干預3 d后，光鏡下可見，各個實驗組間細胞數(shù)目及形態(tài)上有明顯差異。干預組中，隨著TSA濃度的增加，細胞的極性生長越來越明顯，死亡細胞的數(shù)目越來越多，而對照組中細胞形態(tài)及數(shù)目無明顯變化，見圖2。

Figure 1.Morphology of C57BL/6 mouse mesenchymal stem cells under optical microscope.圖1 C57BL/6小鼠骨髓間充質干細胞在光學顯微鏡下的形態(tài)

Figure 2.Morphology of the cells treated with TSA for 3 d(×100).圖2 TSA干預3 d后各組細胞形態(tài)

2 雙硫腙染色鑒定胰島素分泌細胞

加入含GLP-1的高糖培養(yǎng)基7 d后進行雙硫腙染色。光鏡下可見各干預組形成胰島樣細胞，胞漿可見棕黃色囊泡樣結構，且隨著TSA濃度的增加，胞漿內棕黃色囊泡樣著色逐漸減弱，呈負相關;對照組未見胞漿棕黃色囊泡樣結構，見圖3。免疫組化半定量分析顯示，B組胰島素染色陽性面積、陽性率以及胰島素染色積分吸光度顯著高于其它干預組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

3 免疫熒光染色鑒定胰島素分泌

熒光顯微鏡觀察顯示，細胞呈長梭形極性排列，細胞核呈藍色。各干預組均見紅色顆粒狀物質散在均勻分布于胞漿中以及細胞外，且隨著TSA濃度的增加，紅色熒光逐漸減弱，呈負相關;對照組未見紅色顆粒狀物質，見圖4。免疫熒光圖像分析顯示，B組平均熒光強度顯著高于其它干預組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

4 ELISA測定胰島素含量

各組細胞在相應的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后，1 500 r/min離心10 min，收集上清，ELISA測定各組胰島素的含量，結果發(fā)現(xiàn)隨著TSA干預濃度的增加，胰島素的含量逐漸減少。B組胰島素含量顯著高于其它組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

Figure 3.The insulin-secreting cells in each group identified by dithizone staining.圖3 雙硫腙染色鑒定胰島素分泌細胞

Figure 4.Insulin secretion of insulin-producing cells detected by immunofluorescent staining(×200).圖4 免疫熒光染色鑒定胰島素分泌細胞的胰島素分泌

表1 各組免疫組化及免疫熒光半定量分析Table 1.Immunohistochemical and immunofluorescence semi-quantitative analysis in different groups(Mean±SD.n=5)

表2 各組胰島素含量的比較Table 2.Comparison of insulin contents in each group(Mean±SD.n=5)

討 論

糖尿病已經(jīng)成為一個新的流行性疾病。據(jù)最新的調查研究顯示，目前我國成人糖尿病患者約有1.14億［1］。傳統(tǒng)的藥物治療都不能阻止胰島β細胞的進行性衰竭。干細胞誘導分化為胰島素分泌細胞的研究可能為臨床胰島細胞移植提供充足的供體細胞，揭開了糖尿病治療全新的一頁。與胚胎干細胞相比，成體干細胞特別是BMSCs，具有取材方便、無免疫干擾以及避免法律和倫理學的限制等優(yōu)點，許多針對動物模型的研究表明，將BMSCs誘導分化成為胰島素分泌細胞，可以用來治療糖尿?。?-5］。體外BMSCs誘導分化為胰島素分泌細胞的方法有很多，然而這些方法一般所需的周期較長，有的甚至達數(shù)月之久。因此，本領域需要一種簡單、快速的方法，能夠方便有效地將BMSCs誘導分化為胰島素分泌細胞。

組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase，HAT)和組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)決定組蛋白乙酰化狀態(tài)，調節(jié)基因轉錄。HAT和HDAC的異常與腫瘤的發(fā)生有著密切的關系。近年來大量研究表明，組蛋白脫乙酰酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor，HDACI)可抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞分化和凋亡，并可發(fā)揮免疫調節(jié)作用，是新一代具有廣泛應用前景的抗腫瘤藥［6-7］。TSA源自鏈霉菌代謝產(chǎn)物，最先作為抗真菌藥物使用［8］。近來研究表明其具有明顯的組蛋白去乙?；敢种苿┗钚裕瑢Ω伟?、胃癌、口腔癌及人神經(jīng)母細胞瘤等腫瘤細胞具有明顯的細胞毒作用［9］。而且，隨著對胰腺的進一步研究發(fā)現(xiàn)，TSA能夠阻止細胞因子誘導的β細胞凋亡以及核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)下調后 β細胞功能的受損［10］。而且能夠劑量依賴性地顯著增強C2C12骨骼肌細胞胰島素刺激的血糖攝取和糖原合成，以及絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase，AKT)和糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)通路的信號轉導，在HDAC2下調后，這種效應仍然存在，表明HDAC2可能是調節(jié)胰島素敏感性的潛在靶點［11］。也有學者發(fā)現(xiàn)，胰島素受體底物1的乙?；軌蛟鰪娎野彼崃姿峄约按龠M胰島素刺激的信號轉導［12］。Tayaramma 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，55 nmol/L TSA能夠促進小鼠BMSCs分化為胰島樣細胞。目前已經(jīng)證實胰腺間充質干細胞是骨髓來源［14］，表明骨髓來源的間充質干細胞與胰腺的發(fā)生發(fā)育之間存在緊密聯(lián)系。因此，本實驗選取BMSCs作為研究對象，并在Tayaramma等研究基礎上，選取 25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L 和 200 nmol/L 4個梯度濃度作為實驗濃度，驗證Tayaramma等研究結果，探討TSA這種HDACI在誘導干細胞分化方面的作用，并且嘗試尋找此種新型誘導劑應用于該領域的適宜濃度。由于TSA原始包裝是溶于DMSO中，因此本實驗選取單純DMSO與細胞共培養(yǎng)作為對照組。實驗結果顯示，25 nmol/L TSA即可誘導C57BL/6小鼠BMSCs分化成為胰島素分泌細胞，并且分泌胰島素;隨著各干預組TSA濃度的升高，胰島素的分泌量減少。大量研究表明，TSA具有明顯的細胞毒作用，能夠激活腫瘤細胞的凋亡通路［15］以及增強機體對腫瘤的免疫應答［16］。Nakajima等［17］研究發(fā)現(xiàn)，500 nmol/L時 TSA能夠自身誘導低水平的腫瘤細胞凋亡。因此，與 Tayaramma等［13］報道結果相比較，我們認為25 nmol/L TSA可有效誘導C57BL/6小鼠BMSCs分化成為胰島素分泌細胞，且細胞毒性小，是采用TSA進行干預的適宜濃度。

綜上所述，針對目前存在眾多誘導骨髓間充質干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，且這些方法一般所需的周期較長，本研究在國內首次利用一種新型的誘導劑TSA，能夠成功在10 d內將小鼠BMSCs誘導分化為胰島素分泌細胞，并且進一步探討TSA的適宜濃度為25 nmol/L。

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