劉淑瓊， 楊煉紅△， 蔣龍?jiān)?葉晉豪

眾多研究表明，炎癥反應(yīng)貫穿著各種急、慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的整個(gè)病理過程［1］。近有研究顯示P2X7受體位于炎癥反應(yīng)的上游通路，并通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響細(xì)胞的增殖、凋亡［2］。米諾環(huán)素(minocycline，Mino)能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少炎癥介質(zhì)分泌，從而達(dá)到在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用［3］。但是，Mino抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的具體機(jī)制尚未完全明確，是否與P2X7受體是否相關(guān)并未見報(bào)道。本文通過建立脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激小膠質(zhì)細(xì)胞株BV-2細(xì)胞活化模型，探討P2X7受體在Mino抑制BV-2細(xì)胞活化所起的作用。

材料和方法

1 主要試劑和儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco);Mino粉劑和LPS(Sigma);RNAiso Plus、RT試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTMII(TaKaRa);小鼠 TNF-α ELISA 試劑盒和小鼠IL-1β ELISA試劑盒(博士德);實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀(Roche);兔抗鼠 P2X7受體抗體(Alomone);α-tubulinⅠ抗和HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(羊抗兔，羊抗鼠)BCA蛋白定量試劑盒(博彩公司);ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore)。

2 方法

2.1 BV-2細(xì)胞的培養(yǎng) 以含10%胎牛血清的DMEMF/12為培養(yǎng)液，在5%CO2、37℃條件下25 cm2培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)。

2.2 MTT法測定不同濃度Mino對細(xì)胞活力的影響B(tài)V-2細(xì)胞按每孔5 000個(gè)的密度種于96孔板，待細(xì)胞貼壁過夜后，分別加入 0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L 和10 μmol/L Mino作用24 h，用MTT 法計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.3 RT-PCR檢測P2X7受體mRNA表達(dá)的變化按每孔20×105個(gè)細(xì)胞的密度種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁過夜后，將細(xì)胞隨機(jī)分為5組:(1)空白對照組:除培養(yǎng)基外未進(jìn)行任何加藥處理;(2)LPS對照組:加入1 mg/L LPS培養(yǎng)8 h;(3)LPS+0.1 μmol/L Mino組:在同 (2)組處理前加0.1 μmol/L Mino預(yù)處理30 min;(4)LPS+1 μmol/L Mino組:在同(2)組處理前加1 μmol/L Mino預(yù)處理30 min;(5)LPS+10 μmol/L Mino組:在同 (2)組處理前加10 μmol/L Mino預(yù)處理30 min。按TaKaRa公司試劑盒說明操作，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄并通過real-time PCR檢測目標(biāo)cDNA，以β-actin為內(nèi)參照。PCR引物，P2X7受體正義鏈 5′-GTCTTGCACATGATCGTCTTTTC-3′，反義鏈 5′-CCTCTGCTATGCCTTTGACCTT-3′;β-actin 正義鏈 5′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3′，反義鏈 5′-GCTGGAATTACCGCGGCT-3′(均由 TaKa-Ra合成)。反應(yīng)體系為 20 μL，反應(yīng)條件:95℃ 3 min預(yù)變性，95℃ 10 s，55℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，并在每個(gè)循環(huán)延伸末端點(diǎn)收集熒光信號，繪制熔解曲線。所有標(biāo)本均重復(fù)檢測3次，應(yīng)用Relative Quantification Software 1.0軟件分析，計(jì)算出Ct值，通過相對定量(relative quantity，RQ)法，計(jì)算目的基因相對于參照因子的倍數(shù)來比較基因的表達(dá)差異。最終結(jié)果以待測基因/內(nèi)參照的Ct值表示。

2.4 形態(tài)學(xué)觀察 按每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁過夜后，將細(xì)胞隨機(jī)分為5組(分組同2.3，作用時(shí)間為24 h)。處理終止時(shí)在相差顯微鏡下拍照。

2.5 ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α及IL-1β的分泌 處理同2.4，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，按ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α及IL-1β含量。

2.6 Western blotting檢測P2X7受體蛋白表達(dá)的變化 分組及處理同2.4，提取各組細(xì)胞總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取30 μg蛋白提取液，樣品于SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%BSA封閉1 h，隨后分別加入P2X7受體和α-tubulin抗體，4℃孵育過夜，用TBST洗3次，每次10 min。Ⅱ抗孵育1 h后，用TBST洗3次，每次10 min，最后用ECL法顯色。采用Quantity One軟件分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 0.1 ～10 μmol/L Mino 對細(xì)胞活力的影響

由表1可見，0.1～10 μmol/L Mino對 BV-2細(xì)胞活力無顯著影響。

表1 不同濃度Mino處理對BV-2細(xì)胞活力的影響Table 1.The effect of different concentrations of Mino on the viability of BV-2 cells(Mean±SD.n=6)

2 各處理組P2X7受體RT-PCR結(jié)果

如圖1所示，經(jīng) LPS處理后，可見 P2X7受體mRNA表達(dá)量增高，與空白對照組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜ 0.05)。經(jīng) 0.1 μmol/L、1 μmol/L 和 10 μmol/L Mino處理后，P2X7受體mRNA表達(dá)量與LPS處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)?？梢?，0.1～10 μmol/L Mino可抑制該受體的表達(dá)。

Figure 1. Effects of different concentrations of minocycline(Mino)on the mRNA expression of P2X7 receptor in LPS-induced BV-2 cells.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs LPS group.圖1 各處理組P2X7受體的表達(dá)量

3 各處理組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

如圖2所示，正常情況下，BV-2細(xì)胞保持靜息狀態(tài)，即胞體較小，有細(xì)長的突起，呈梭形或者分枝狀;經(jīng)1 mg/L LPS激活后，BV-2細(xì)胞呈圓形，突起回縮，易聚團(tuán)，或見細(xì)小的偽足，貼壁性較差，即為“阿米巴狀”。而LPS加不同濃度Mino環(huán)素處理組，細(xì)胞的激活狀態(tài)受到抑制。

Figure 2.Morphological changes of the BV-2 cells(×200).A:control group;B:LPS group;C:LPS+0.1 μmol/L group;D:LPS+1 μmol/L group;E:LPS+10 μmol/L group.圖2 各處理組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

4 各處理組細(xì)胞TNF-α及IL-1β的分泌

如圖3、4所示，LPS處理24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α和IL-1β分泌增高，與空白對照組相比有顯著差異(P＜0.01)。Mino可呈量效相關(guān)地減少炎癥因子的分泌，在0.1～10 μmol/L范圍內(nèi)，Mino的劑量越大，細(xì)胞TNF-α及IL-1β分泌越受抑制，與LPS對照組相比均有顯著差異(P＜0.01)。

Figure 3.TNF-α concentration in the BV-2 cells with different treatments.Mean±SD.n=5.##P＜0.01 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs LPS group.圖3 各處理組細(xì)胞TNF-α的分泌

Figure 4.IL-1β concentration in the BV-2 cells with different treatments.Mean±SD.n=5.##P＜0.01 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs LPS group.圖4 各處理組細(xì)胞IL-1β的分泌

5 Western blotting檢測P2X7受體蛋白表達(dá)的變化

LPS組的曝光帶較空白對照組強(qiáng)，而加了Mino的各處理組曝光帶均較LPS組弱。同時(shí)，各組間tubulin強(qiáng)度一致，見圖5。

Figure 5.Effects of different concentrations of Mino on the protein expression of P2X7 receptor in LPS-induced BV-2 cells.A:control group;B:LPS group;C:LPS+0.1 μmol/L group;D:LPS+1 μmol/L group;E:LPS+10 μmol/L group.圖5 Western blotting檢測P2X7受體蛋白表達(dá)的變化

討 論

P2X7受體是嘌呤核苷酸受體家族中的一員，廣泛表達(dá)于神經(jīng)元、星形細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、少突膠質(zhì)祖細(xì)胞、Schwann細(xì)胞和 Müller細(xì)胞［4］。中樞神經(jīng)受損時(shí)，受損神經(jīng)元囊泡中的 ATP釋放，激活小膠質(zhì)細(xì)胞膜上的P2X7受體，進(jìn)而釋放大量的TNF-α和 IL-β等炎癥因子。炎癥反應(yīng)是神經(jīng)系統(tǒng)疾病重要的病理過程，而小膠質(zhì)細(xì)胞是炎癥介質(zhì)的主要來源。P2X7受體因其在小膠質(zhì)細(xì)胞主導(dǎo)的炎癥介質(zhì)合成、分泌中的核心地位，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理演變中扮演著重要的角色。在阿爾茨海默?。?］、帕金森?。?］、缺血缺氧性腦?。?］、癲癇［8］等疾病中均可見小膠質(zhì)細(xì)胞上P2X7受體表達(dá)增多，同時(shí)伴有 IL-1β、IL-6、TNF-α 及 COX-2的分泌增多。阻斷P2X7受體表達(dá)的上調(diào)或激活無疑是炎癥相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的靶點(diǎn)之一。

作為第2代半合成的四環(huán)類廣譜抗生素，Mino在神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中有著廣泛的探索性的應(yīng)用。其中機(jī)制之一即為其對小膠質(zhì)細(xì)胞的抑制作用。有文獻(xiàn)報(bào)道［9］，P2X7受體特異性激動(dòng)劑BZ-ATP能引起B(yǎng)V-2及原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞ERK1/2、JNK1/2等通路的活化，而Mino可抑制這一變化?；谝陨衔墨I(xiàn)，我們探討了P2X7受體是否與Mino抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的過程相關(guān)。

在本模型中，在1 mg/L LPS的刺激下，BV2細(xì)胞P2X7受體基因及蛋白水平上的表達(dá)均可見升高。該結(jié)論在不同的細(xì)胞模型中也可看到。Zhang等［10］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS刺激人外周血單核細(xì)胞4 h后，P2X7 mRNA的表達(dá)升高，12 h后逐漸下降。而在培養(yǎng)的人小膠質(zhì)細(xì)胞中［11］，未接受LPS刺激的細(xì)胞表達(dá)少量P2X7受體，而LPS刺激1 h，該受體的表達(dá)開始升高，8 h后表達(dá)達(dá)到高峰期。有文獻(xiàn)［12］表明，P2X7受體表達(dá)水平與小膠質(zhì)細(xì)胞活性相關(guān)聯(lián)。Monif等［13］的研究表明，P2X7受體過表達(dá)時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞從靜止時(shí)長突觸分支、小胞體的形態(tài)變?yōu)榘w肥大、突觸回縮的阿米巴態(tài);細(xì)胞因子也伴隨增多。這與我們形態(tài)學(xué)觀察及ELISA檢測細(xì)胞上清液TNF-α及IL-1β結(jié)果也相符。類似結(jié)論在原代小膠質(zhì)細(xì)胞模型上也可以看到［14］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的Mino可抑制該受體的表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞上清液TNF-α及IL-1β分泌受抑制。我們推測，這可能與Mino抑制P2X7受體相關(guān)。有文獻(xiàn)表明［15］，P2X7受體的活性調(diào)節(jié)參與了TNF-α及IL-1β的合成及分泌過程。由此可推測，Mino通過抑制P2X7的表達(dá)及改變P2X7的活性，從而抑制BV-2細(xì)胞的活化。這將為以小膠質(zhì)細(xì)胞活化為主要病理特征的神經(jīng)退行性病變、癲癇、缺血性卒中等疾病的治療提供新的思路。

［1］ Cunningham C.Microglia and neurodegeneration:the role of systemic inflammation［J］.Glia，2013，61(1):71-90.

［2］ Takenouchi T，Nakai M，Iwamaru Y，et al.The activation of P2X7 receptor impairs lysosomal functions and stimulates the release of autophagolysosomes in microglial cells［J］.Immunol，2009，182(4):2051-2062.

［3］ Vezzani A，F(xiàn)riedman A.Brain inflammation as a biomark in epilepsy［J］.Biomark Med，2011，5(5):607-614.

［4］ Yu Y，Ugawa S，Ueda T，et al.Cellular localization of P2X7 receptor mRNA in the rat brain［J］.Brain Res，2008，1194(15):45-55.

［5］ McLarnon JG，Ryu JK，Walker DG，et al.Upregulated expression of purinergic P2X7 receptor in Alzheimer disease and amyloid-beta peptide-treated microglia and in peptide-injected rat hippocampus［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2006，65(11):1090-1097.

［6］ Hracskó Z，Baranyi M，Cs?lle C，et al.Lack of neuroprotection in the absence of P2X7 receptors in toxin-induced animal models of Parkinson’s disease［J］.Mol Neurodegener，2011，6:28.

［7］ Melani A，Amadio S，Gianfriddo M.P2X7 receptor modulation on microglial cells and reduction of brain infarct caused by middle cerebral artery occlusion in rat［J］.J Cerebral Blood Flow Metab，2006，26(7):974-982.

［8］ Rappold PM，Lynd-Balta E，Joseph SA.P2X7 receptor immunoreactive profile confined to resting and activated microglia in the epileptic brain［J］.Brain Res，2006，1089(1):171-178.

［9］ Nikodemova M，Duncan ID，Watters JJ.Minocycline exerts inhibitory effects on multiple mitogen-activated protein kinases and IκBα degradation in a stimulus-specific manner in microglia［J］.J Neurochem，2006，96(2):314-323.

［10］ Zhang XJ，Zheng GG，Ma XT，et al.Efects of various inducers on the expression of P2X7 receptor in human peripheral blood mononuclear cells［J］.Sheng Li Xue Bao，2005，57(2):193-198.

［11］Monif M，Burnstockb G，William DA.Microglia:proliferation and activation driven by the P2X7 receptor［J］.Int J Biochem Cell Biol，2010，42(11):1753-1756.

［12］Choi HB，Ryu JK，Kim SU，et al.Modulation of the purinergic P2X7 receptor attenuates lipopolysaccharide mediated microglial activation and neuronal damage in inflamed brain［J］.J Neurosci，2007，27(18):4957-4968.

［13］ Monif M，Reid CA，Powell KL，et al.The P2X7 receptor drives microglial activation and proliferation:a trophic role for P2X7R pore［J］.J Neurosci，2009，29(12):3781-3791.

［14］楊煉紅，劉淑瓊，徐菁特，等.米諾環(huán)素對癲癇海馬小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7表達(dá)的影響［J］.嶺南急診醫(yī)學(xué)雜志，2012，17(6):401-403.

［15］ Kim JE，Ryu HJ，Kang TC.P2X7 receptor activation ameliorates CA3 neuronal damage via a tumor necrosis factor-α-mediated pathway in the rat hippocampus following status epilepticus［J］.J Neuroinflamm，2011，8:62.