劉 宇， 高 東， 鐘靜靜， 萬巖巖， 李翔英， 靳廣毅， 王曉冬

氟尿嘧啶是一種目前臨床上常用的廣譜抗腫瘤藥物，對結(jié)腸癌有較好的效果，對其它消化系統(tǒng)癌癥、宮頸癌、卵巢癌等也有效［1-2］。氟尿嘧啶主要通過抑制脫氧胸苷酸合成酶，阻斷脫氧尿苷酸甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣剀账?，進(jìn)而干擾DNA的合成以發(fā)揮抗腫瘤效果，屬于抗代謝類抗腫瘤藥物。但氟尿嘧啶本身毒性較大，用藥后患者易發(fā)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如骨髓抑制、胃腸道及神經(jīng)系統(tǒng)損害等。阿司匹林是一種歷史悠久的解熱鎮(zhèn)痛藥，近年來研究表明阿司匹林能顯著降低結(jié)腸癌、食管癌、前列腺癌、胰腺癌等腫瘤發(fā)病的危險性［3］，并具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長增殖的作用［4］。本研究主要通過MTT法觀察阿司匹林與氟尿嘧啶協(xié)同抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長增殖的作用，旨在采用低濃度的藥物協(xié)同作用發(fā)揮藥效并減低不良反應(yīng)，并且通過Hoechst染色、caspase活性測試、流式細(xì)胞術(shù)、real-time PCR、Western blotting等方法探討其作用機(jī)制，為今后可能的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 主要試劑

阿司匹林、氟尿嘧啶、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲亞砜(DMSO)和碘化丙啶(PI)購自 Sigma-Aldrich;Hoechst 33258、casapse-3、caspase-8、caspase-9 試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;RNA提取試劑盒和實(shí)時熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq)購自 TaKaRa;Bcl-2、Bax、βactinⅠ抗及相應(yīng)Ⅱ抗購自Santa Cruz;RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自HyClone，其它常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116和SW620為本實(shí)驗(yàn)室保藏并常規(guī)傳代培養(yǎng)，生長于含有10%滅活胎牛血清、青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);細(xì)胞常規(guī)每3～4 d傳代1次，所有實(shí)驗(yàn)采用對數(shù)生長期細(xì)胞。

體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞分成4組進(jìn)行處理:空白對照組(control group)，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);阿司匹林組(aspirin group)，用含 100 μmol/L阿司匹林的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);氟尿嘧啶組(5-fluorouracil，5-Fu)，用含 0.3、1、3、10、30 或 100 μmol/L氟尿嘧啶的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);氟尿嘧啶+阿司匹林組(5-Fu+aspirin)，用同時含有不同濃度的氟尿嘧啶與100 μmol/L阿司匹林的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

3 方法

3.1 MTT法 HCT-116或SW620細(xì)胞常規(guī)胰酶消化成單細(xì)胞懸液，1×108/L細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜;次日每孔加入含100 μmol/L阿司匹林和0.3、1、3、10、30、100 μmol/L 氟尿嘧啶的培養(yǎng)基;作用一定時間后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄上清每孔加入100 μL DMSO，室溫振蕩搖勻，酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度，并計算不同藥物作用下細(xì)胞的存活率。

3.2 Hoechst 33258染色法 1×108/L HCT-116細(xì)胞接種于24孔板，加入含100 μmol/L阿司匹林和1、3、10、30、100 μmol/L 氟尿嘧啶的培養(yǎng)基作用48 h 后，棄上清，4%甲醛固定10 min;棄上清，Hoechst 33258染色5 min;熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核狀態(tài)并拍照。

3.3 Caspase-3、-8、-9活性的檢測 1×108/L HCT-116細(xì)胞接種于6孔板，加入含100 μmol/L阿司匹林和1、3、10、30、100 μmol/L 氟尿嘧啶的培養(yǎng)基作用48 h后，收集細(xì)胞，并按照試劑盒操作說明進(jìn)行活性檢測。

3.4 流式細(xì)胞術(shù) 1×108/L HCT-116細(xì)胞接種于6孔板，加入含100 μmol/L阿司匹林和100 μmol/L氟尿嘧啶的培養(yǎng)基作用48 h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌并重懸，加入RNase A 37℃作用30 min，再加入PI于4℃作用30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。

3.5 Real-time PCR 1×108/L HCT-116細(xì)胞接種于6孔板，加入含100 μmol/L阿司匹林和100 μmol/L氟尿嘧啶的培養(yǎng)基作用48 h后，收集細(xì)胞提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時熒光定量PCR按照試劑盒操作說明進(jìn)行，引物序列見表1，具體反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，59 ℃ 20 s，40 個循環(huán)。不同樣本目的基因表達(dá)的相對差異量用2-ΔΔCt法計算。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3.6 Western blotting 1×108/L HCT-116細(xì)胞接種于6孔板，加入含100 μmol/L阿司匹林和100 μmol/L氟尿嘧啶的培養(yǎng)基作用48 h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白并用BCA法進(jìn)行蛋白定量。樣品于SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%BSA封閉1 h，Ⅰ抗4℃過夜，Ⅱ抗1 h，ECL法顯色。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均用數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 阿司匹林與氟尿嘧啶協(xié)同抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長增殖

單獨(dú)應(yīng)用氟尿嘧啶對HCT116細(xì)胞的生長增殖具有抑制作用，且作用效果呈時間及濃度依賴性。單獨(dú)應(yīng)用100 μmol/L阿司匹林對HCT116細(xì)胞增殖沒有明顯的抑制效果，但將100 μmol/L阿司匹林與不同濃度的氟尿嘧啶協(xié)同應(yīng)用于HCT116細(xì)胞時，細(xì)胞增殖能力被更有效地抑制，且此種協(xié)同抑制同樣具有時間及濃度依賴性，見圖1及表2。同時，協(xié)同應(yīng)用阿司匹林與氟尿嘧啶于SW620結(jié)腸癌細(xì)胞時，出現(xiàn)相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表2。

Figure 1.Changes of HCT116 cell viability after treatment with various concentrations of 5-Fu and 100 μmol/L aspirin for 24，48 and 72 h.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs 5-Fu group.圖1 5-Fu與阿司匹林對HCT116細(xì)胞存活率的影響

表2 5-Fu單獨(dú)作用或在阿司匹林協(xié)同下對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的IC50值Table 2.The IC50values of 5-Fu alone or combined with aspirin(100 μmol/L)for the proliferation of colon cancer cell lines(μmol/L.Mean±SD.n=3)

2 阿司匹林與氟尿嘧啶協(xié)同誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)

HCT116細(xì)胞用Hoechst 33258染色后通過熒光顯微鏡觀察可見，未經(jīng)處理組活細(xì)胞核呈均勻熒光，藥物處理組則表現(xiàn)出不同程度的濃染致密顆粒狀熒光，即發(fā)生細(xì)胞凋亡的典型特征。單獨(dú)應(yīng)用100 μmol/L氟尿嘧啶48 h后可見凋亡形態(tài)，單獨(dú)應(yīng)用30 μmol/L氟尿嘧啶則凋亡形態(tài)不明顯。不同濃度氟尿嘧啶與100 μmol/L阿司匹林協(xié)同作用48 h后，細(xì)胞核皺縮碎裂、染色質(zhì)濃縮等凋亡形態(tài)均更加顯著，見圖2。

Figure 2.Nuclear morphology of HCT116 cells treated with 5-Fu and aspirin for 48 h (Hoechst 33258 staining，×200).A:control;B:30 μmol/L 5-Fu;C:30 μmol/L 5-Fu+100 μmol/L aspirin;D:100 μmol/L 5-Fu;E:100 μmol/L 5-Fu+100 μmol/L aspirin.圖2 5-Fu與阿司匹林對HCT116細(xì)胞核形態(tài)的影響

3 阿司匹林與氟尿嘧啶協(xié)同應(yīng)用激活結(jié)腸癌細(xì)胞caspase酶活性

HCT116細(xì)胞用不同濃度氟尿嘧啶刺激48 h后，caspase-3、-8、-9酶活性均有所提高，且活性增強(qiáng)呈濃度依賴性，但單獨(dú)應(yīng)用100 μmol/L阿司匹林則對caspase酶活性幾無影響。100 μmol/L阿司匹林與氟尿嘧啶協(xié)同應(yīng)用后，相對于單用氟尿嘧啶，細(xì)胞的caspase酶活性明顯增加。100 μmol/L氟尿嘧啶與阿司匹林合用后，caspase-3、-8、-9酶活性分別由1.7、3.2和2.8倍提高到2.2、4.0和3.4倍，見圖3。

4 阿司匹林與氟尿嘧啶協(xié)同應(yīng)用影響結(jié)腸癌細(xì)胞周期

HCT116細(xì)胞藥物作用48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)100 μmol/L氟尿嘧啶顯著提高了sub-G1及S期的比例。單用100 μmol/L阿司匹林對細(xì)胞周期無明顯影響。100 μmol/L阿司匹林與氟尿嘧啶協(xié)同作用后，與單用氟尿嘧啶相比，細(xì)胞凋亡(sub-G1期)比例有所增加，G0/G1期及S期變化則無顯著差異，見圖4、表3。

5 阿司匹林與氟尿嘧啶協(xié)同應(yīng)用影響B(tài)cl-2和Bax mRNA水平

如圖5所示，單獨(dú)應(yīng)用阿司匹林對Bcl-2 mRNA水平無明顯影響，單獨(dú)應(yīng)用氟尿嘧啶則抑制Bcl-2 mRNA水平，2種藥物協(xié)同應(yīng)用更顯著下調(diào) Bcl-2 mRNA水平，但阿司匹林和氟尿嘧啶對Bax mRNA水平均無明顯影響。

6 阿司匹林與氟尿嘧啶協(xié)同應(yīng)用影響B(tài)cl-2和Bax蛋白表達(dá)

如圖6所示，單獨(dú)應(yīng)用阿司匹林對蛋白表達(dá)無明顯影響，單獨(dú)應(yīng)用氟尿嘧啶抑制Bcl-2表達(dá)，協(xié)同應(yīng)用后抑制Bcl-2表達(dá)效果更顯著，但2種藥物對Bax表達(dá)水平無明顯影響。

討 論

Figure 3.Changes of caspase-3，caspase-8 and caspase-9 activity in HCT116 cells after 5-Fu treatment for 48 h with or without 100 μmol/L aspirin.Mean ± SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs 5-Fu group.圖3 5-Fu與阿司匹林對HCT116細(xì)胞caspase酶活性的影響

氟尿嘧啶和阿司匹林是臨床上常用的2種藥物。氟尿嘧啶主要用于治療結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤，且文獻(xiàn)顯示氟尿嘧啶可以誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡以達(dá)到抗腫瘤的效果［5］。阿司匹林是一種常用的非甾體抗炎藥，主要臨床作用為解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等。近期研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林可以預(yù)防結(jié)腸癌等腫瘤發(fā)生，且對腫瘤細(xì)胞凋亡也有一定的影響［6-7］。已有文獻(xiàn)報道將阿司匹林與氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用于HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞，通過誘發(fā)凋亡取得較好的腫瘤抑制效果［8］。本課題則將2種藥物聯(lián)合應(yīng)用于HCT116及SW620結(jié)腸癌細(xì)胞，證明2藥均采用較低的藥物濃度可以達(dá)到單藥高濃度時的抑制腫瘤效果，并研究其相關(guān)機(jī)制。另外，之前研究結(jié)果僅證明無明顯細(xì)胞毒性的低濃度氟尿嘧啶與高濃度阿司匹林聯(lián)合應(yīng)用的效果，而本研究則主要探討低濃度阿司匹林對氟尿嘧啶毒性的增強(qiáng)作用。

Figure 4.The cell cycle of HCT116 cells after treatment with 100 μmol/L 5-Fu or 100 μmol/L aspirin for 48 h.Debris represented the apoptotic cells(sub-G1phase).A:control;B:100 μmol/L aspirin;C:100 μmol/L 5-Fu;D:100 μmol/L 5-Fu+100 μmol/L aspirin.圖4 5-Fu與阿司匹林對HCT116細(xì)胞周期的影響

表3 5-Fu與阿司匹林對HCT116細(xì)胞周期的影響Table 3.Effects of 5-Fu and aspirin on cell cycle of HCT116 cells(%.Mean±SD.n=3)

Figure 5.Relative mRNA expression levels of Bcl-2 and Bax in HCT116 cells after treatment with 100 μmol/L 5-Fu or 100 μmol/L aspirin for 48 h.Mean ±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs 5-Fu group.圖5 5-Fu與阿司匹林影響B(tài)cl-2和Bax mRNA的表達(dá)

阿司匹林采用對細(xì)胞生長增殖幾乎沒有影響的濃度(100 μmol/L)與氟尿嘧啶協(xié)同應(yīng)用，結(jié)果表明與單用氟尿嘧啶相比，抑制HCT116和SW620結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的效果明顯增強(qiáng)，IC50顯著降低，且上述效果具有時間和濃度依賴性。Hoechst 33258染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)100 μmol/L阿司匹林協(xié)同作用后，氟尿嘧啶可以誘發(fā)HCT116細(xì)胞產(chǎn)生更明顯的凋亡形態(tài)(細(xì)胞核皺縮、碎裂等)及細(xì)胞凋亡(sub-G1期)比例增加，越高濃度的氟尿嘧啶誘發(fā)凋亡的作用越明顯。另外，氟尿嘧啶是一種周期特異性藥物，可以將腫瘤細(xì)胞有效阻滯在S期［9］。阿司匹林也有報道較大濃度時誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞G0/G1期比例增高［10］。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)氟尿嘧啶作用下，HCT116細(xì)胞的S期比例確有明顯提高。但低濃度阿司匹林協(xié)同作用對于S期及G0/G1期比例沒有明顯效果，即2種藥物協(xié)同殺傷HCT116細(xì)胞的主要作用機(jī)制在于誘發(fā)細(xì)胞凋亡，協(xié)同影響S期、G0/G1期效果甚微。

Figure 6.Relative protein expression levels of Bcl-2 and Bax in HCT116 cells after treatment with 100 μmol/L 5-Fu or 100 μmol/L aspirin for 48 h.Mean ± SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs 5-Fu group.圖6 5-Fu與阿司匹林影響B(tài)cl-2和Bax蛋白的表達(dá)

經(jīng)典的細(xì)胞凋亡包括外源性途徑和內(nèi)源性途徑兩種，外源性途徑(死亡受體途徑)caspase級聯(lián)反應(yīng)包括上游凋亡啟動因子caspase-8和下游凋亡執(zhí)行因子caspase-3，內(nèi)源性途徑(線粒體途徑)則包括上游凋亡啟動因子caspase-9和下游凋亡執(zhí)行因子caspase-3［11］。已有文獻(xiàn)表明氟尿嘧啶可以通過上述2種途徑誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡［12-13］。Caspase活性測試結(jié)果表明，單用氟尿嘧啶導(dǎo)致HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞caspase-3、-8、-9 激活，協(xié)同應(yīng)用 100 μmol/L 阿司匹林后caspase-3、-8、-9活性更為提高，且此種激活能力具有濃度依賴性。Bcl-2蛋白家族是調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要因素之一，包括以Bcl-2為代表的抗凋亡蛋白和以Bax為代表的促凋亡蛋白。Bax主要負(fù)責(zé)在線粒體的外膜上形成通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔道，使細(xì)胞色素C等物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并引發(fā)凋亡，Bcl-2則可以結(jié)合并抑制促凋亡蛋白，使凋亡不會發(fā)生［14］。Real-time PCR及Western blotting檢測證明氟尿嘧啶抑制抗凋亡bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯，進(jìn)而誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞發(fā)生凋亡，且阿司匹林具有協(xié)同效果，但藥物對于促凋亡bax基因則影響微弱。

上述實(shí)驗(yàn)表明在無明顯細(xì)胞毒性的低濃度阿司匹林作用下，氟尿嘧啶誘發(fā)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用顯著增強(qiáng)，且外源性及內(nèi)源性凋亡途徑均發(fā)揮效果。兩藥合用的抗腫瘤效果與抑制Bcl-2表達(dá)呈正相關(guān)，但與Bax表達(dá)無明顯關(guān)系?？傊?，氟尿嘧啶和阿司匹林可以通過誘發(fā)細(xì)胞凋亡途徑，協(xié)同發(fā)揮抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長增殖的效果。

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