張文峰， 賈 筠， 吳鳳麟， 沈 晗， 邵紅偉△，黃樹林△

存活蛋白(survivin)作為凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的成員，在多數(shù)人類腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，因在抑制細(xì)胞凋亡與調(diào)控細(xì)胞分裂中起著重要作用而被廣泛研究［1-2］。近些年陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了 survivin-2α、survivin-2B、survivin-ΔEx3 和 survivin-3B等剪接變異體［3-4］。與 survivin類似，sur-vivin-2B剪接變異體也含有4個(gè)外顯子，只是在其中一個(gè)外顯子中插入了一段69 bp的序列，它們蛋白序列僅為23個(gè)氨基酸的差異。研究表明survivin-2B具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能，僅在人類正常組織細(xì)胞中表達(dá)［5］。一段23個(gè)氨基酸的差異導(dǎo)致具有與survivin截然相反的功能，這已成為目前大家關(guān)注的焦點(diǎn)，但是具體分子機(jī)制尚不明確。本研究在人乳腺癌細(xì)胞株MCF7中過表達(dá)survivin-2B，誘導(dǎo)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期阻滯，然后利用一種基于多重聚合酶鏈反應(yīng)(multiplexpolymerasechain reaction，mPCR)的GeXP多基因遺傳表達(dá)分析系統(tǒng)，分析21個(gè)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)變化情況，初步探討survivin-2B誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能途徑，為進(jìn)一步研究survivin-2B的功能奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料和試劑

真核表達(dá)載體 pcDNA3.1載體、RNA提取的TRIzol試劑、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和細(xì)胞粉末培養(yǎng)基DMEM均購(gòu)自Invitrogen;反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自TaKaRa;Taq聚合酶購(gòu)自Thermo Fisher;293細(xì)胞(人胚腎上皮細(xì)胞)和MCF7細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存;Human Breast CancerPlex Kit購(gòu)自Beckman。

Nanodrop 2000紫外分光光度計(jì)購(gòu)自 Thermo，PCR儀為Biometra產(chǎn)品，GeXP系統(tǒng)及相關(guān)耗材均購(gòu)自Beckman，臺(tái)式離心機(jī)為 Thermo Fisher Scientific產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀購(gòu)自Beckman。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中用DMEM完全培養(yǎng)液(補(bǔ)加10%新生牛血清和2 mol/L谷氨酸)培養(yǎng)MCF7細(xì)胞。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進(jìn)行脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞。

2.3 重組載體pcDNA3.1-survivin-2B的構(gòu)建 Survivin-2B基因僅在人的正常細(xì)胞中表達(dá)，選取人的腎上皮細(xì)胞系293細(xì)胞，提取其總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以該cDNA為模板，PCR擴(kuò)增survivin-2B片段，上游引物 5’-CCGGAATTCACCATGGGTGCCCCGACGTTG-3’，下游引物 5’-CCGCTCGAGTCAATCCATGGCAGCCAGC-3’。設(shè)計(jì)引物時(shí)，兩端加EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)(見引物的下劃線部分)。擴(kuò)增條件:95 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物于1.2%agarose凝膠電泳。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒提純后，經(jīng)EcoR I和 Xho I限制性內(nèi)切酶酶切，與經(jīng)EcoR I和Xho I酶切后的真核表達(dá)載體pcDNA3.1連接;轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，氨芐抗性篩選陽(yáng)性克隆;擴(kuò)大培養(yǎng)陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌落PCR初步驗(yàn)證后，將候選重組載體送Invitrogen測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證直至重組表達(dá)載體pcDNA3.1-survivin-2B構(gòu)建成功。

2.4 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 將空載體pcDNA3.1及重組載體pcDNA3.1-survivin-2B轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞用細(xì)胞刮小心刮下，800×g離心10 min，棄上清;PBS洗1次，800×g離心10 min棄上清;加2 mL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，800×g離心 10 min棄上清;加100 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，隨后加入5 μL annexin V-PE，室溫避光孵育15 min;加入2 mL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，800×g，離心 10 min棄上清;加500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，隨后加入5 μL 7-AAD，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.5 細(xì)胞周期的測(cè)定 胰酶適度消化細(xì)胞，用培養(yǎng)液吹打，800×g離心 10 min去上清;PBS洗1次，800×g離心10 min棄上清;加0.5 mL PBS吹勻;用5 mL注射器將細(xì)胞吸起，用力打入5 mL 70% 預(yù)冷乙醇中，4℃固定過夜;800×g離心15 min收集固定細(xì)胞，PBS洗2次;用0.4 mL PBS重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)至試管中輕輕吹打;加RNase-A約3 μL至終濃度約為50 mg/L，37 ℃水浴消化30 min;加 PI約50 μL至終濃度約為65 mg/L，在冰浴中避光染色30 min;經(jīng)尼龍網(wǎng)過濾，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.6 總RNA提取及第1鏈cDNA的合成 用DEPC處理的PBS將培養(yǎng)細(xì)胞洗2遍，總RNA提取按照Invitrogen試劑盒提供的方法進(jìn)行，總RNA經(jīng)濃度測(cè)定后，分別取 320 ng、160 ng、80 ng、40 ng、20 ng、10 ng、5 ng、2.5 ng和1.25 ng總 RNA，按照 PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進(jìn)行第1鏈cDNA合成，引物為貝克曼公司Human Breast Cancer-Plex Kit提供的有關(guān)25個(gè)基因特異性引物混合物。條件為:65℃ 5 min，50℃ 60 min，95℃ 5 min。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 選取貝克曼庫(kù)爾特公司Human Breast CancerPlex Kit，該試劑盒包含25個(gè)基因，其中3個(gè)為內(nèi)參照基因，1個(gè)為內(nèi)質(zhì)控基因，21個(gè)腫瘤相關(guān)基因(見表1)。提取細(xì)胞總RNA并經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量，分別取 320 ng、160 ng、80 ng、40 ng、20 ng、10 ng、5 ng、2.5 ng 和 1.25 ng 總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA后，通用引物(上游加熒光標(biāo)記FAM)和特異性嵌合引物(5′末端連接通用引物序列)按一定比例分別加入，先由正、反向嵌合引物的特異性序列結(jié)合到cDNA模板啟動(dòng)PCR反應(yīng)，經(jīng)過數(shù)個(gè)循環(huán)后，分別擴(kuò)增出上、下游通用引物的互補(bǔ)序列;最后再以此為模板，由通用引物主導(dǎo)，與其互補(bǔ)序列結(jié)合來進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)在一個(gè)體系同時(shí)進(jìn)行25重PCR反應(yīng)，每個(gè)目的基因PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度大小的差異可經(jīng)毛細(xì)管電泳區(qū)分，其熒光的強(qiáng)度反映目的基因mRNA模板量。按照PrimeSTAR HS試劑盒說明書配制9管25 μL反應(yīng)體系，每管多重體系反應(yīng)包括:5 ×PrimeSTAR Buffer 5 μL，dNTP Mixture(各 2.5 mmol/L)2 μL，DNA polymerase(2.5 ×106U/L)0.25 μL，上、下游嵌合引物(各引物均為0.5 μmol/L)各取 1 μL，使反應(yīng)體系 終 濃度為20 nmol/L，上游FAM標(biāo)記熒光通用引物和下游通用引物(10 μmol/L)各取 2 μL，使反應(yīng)體系終濃度800 nmol/L，模板 cDNA 1 μL，用不含核酸酶的水補(bǔ)至25 μL。對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定反應(yīng)條件為:98 ℃ 4 min，98 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。擴(kuò)增完成后取0.5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，利用GeXP多基因表達(dá)分析系統(tǒng)檢測(cè)每個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)化熒光比值。

表1 目的基因的介紹Table 1.Introduction of the interest genes

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 重組載體pcDNA3.1-survivin-2B的構(gòu)建及表達(dá)

Survivin-2B基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為468個(gè)堿基，加上2條引物各自攜帶的12個(gè)堿基的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基序列，擴(kuò)增產(chǎn)物理論長(zhǎng)度為492個(gè)堿基。PCR擴(kuò)增survivin-2B基因片段的結(jié)果見圖1A，在大約500 bp處獲得條帶，與預(yù)期大小相符合。將測(cè)序正確的重組表達(dá)載體pcDNA3.1-survivin-2B及空載體pcDNA3.1經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞48 h后，提取MCF7細(xì)胞總RNA，以oligo(dT)為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;以該cDNA為模板，以survivin-2B基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證，擴(kuò)增產(chǎn)物于1.2%agarose凝膠電泳(圖1B)，僅在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-survivin-2B重組質(zhì)粒細(xì)胞中獲得單一目的條帶，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的MCF7細(xì)胞中沒有出現(xiàn)目的條帶，表明survivin-2B基因在MCF7細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)本底表達(dá)，重組載體pcDNA3.1-survivin-2B轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞后，survivin-2B基因有效表達(dá)。

2 Survivin-2B引起腫瘤細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期阻滯

轉(zhuǎn)染48 h后，相比于空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染對(duì)照組，survivin-2B轉(zhuǎn)染組早期凋亡細(xì)胞比例顯著增加(2.7%上升至10.3%)，晚期凋亡細(xì)胞比例也有所提高(1.3%上升至10.4%)，凋亡細(xì)胞比例顯著增加(4.0%上升至20.7%)，表明survivin-2B誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖2)。相比于空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染對(duì)照組，survivin-2B轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期中G2/M期的細(xì)胞比例明顯增加(6.4%上升至22.4%)，而G1期和S期的細(xì)胞比例未見顯著變化，表明過表達(dá)survivin-2B基因能夠引起細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，見圖3。

Figure 1. Construction of recombinant eukaryotic expression plasmid expressing survivin-2B(A)and its expression in MCF7 cells(B).M:DNA marker DL2000;1:survivin-2B gene;2:negative control.圖1 重組載體pcDNA3.1-survivin-2B的構(gòu)建及在MCF7細(xì)胞中的表達(dá)

3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

不同起始模板條件下，25個(gè)目的基因擴(kuò)增后均有對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化熒光比值，根據(jù)此數(shù)值繪制25個(gè)目的基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2。

Figure 2.The apoptosis of MCF-7 cells was detected by flow cytometry after the gene transfection.A:MCF-7 cells;B:MCF-7 cells transfected with pcDNA3.1;C:MCF-7 cells transfected with pcDNA3.1-survivin-2B.圖2 基因轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果

Figure 3.The cell cycle of MCF-7 cells transfected with survivin-2B.A:MCF-7 cells;B:MCF-7 cells transfected with pcDNA3.1;C:MCF-7 cells transfected with pcDNA3.1-survivin-2B.圖3 基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果

表2 不同總RNA量條件下目的基因擴(kuò)增后的標(biāo)準(zhǔn)化熒光比值Table 2.Normalized values of interest genes with different amounts of total RNA

4 腫瘤相關(guān)基因表達(dá)變化情況

總共有10個(gè)基因的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中表達(dá)下調(diào)8個(gè)，表達(dá)上調(diào)2個(gè);這10個(gè)基因在對(duì)照組與轉(zhuǎn)染survivin-2B實(shí)驗(yàn)組中的標(biāo)準(zhǔn)化熒光比值均位于所對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測(cè)范圍內(nèi);表達(dá)變化最大的為醛脫氫酶4家族成員A1(aldehyde dehydrogenase 4 family member A1，ALDH4A1)，表達(dá)下降48%;變化最小的為胞質(zhì)分裂調(diào)控蛋白1(protein regulator of cytokinesis 1，PRC1)，表達(dá)上調(diào) 1.08倍，見圖4。

以往研究發(fā)現(xiàn)，EGLN1的缺失會(huì)抑制細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transforming growth factor β，TGF-β)的表達(dá)以及 TGF-β蛋白的胞內(nèi)加工［6］;TGF-β能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中醛脫氫酶1(aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1)的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)ALDH1的表達(dá)與抑制因子Bcl-2的表達(dá)呈正相關(guān)［7-8］。綜合本研究結(jié)果，我們推測(cè)survivin-2B誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能途徑為survivin-2B下調(diào)EGLN1的表達(dá)，EGLN1表達(dá)下降后導(dǎo)致TGF-β表達(dá)下調(diào)，然后導(dǎo)致ALDH1表達(dá)受到抑制，從而導(dǎo)致Bcl-2表達(dá)下降而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其有關(guān)該信號(hào)通路的細(xì)節(jié)有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

Figure 4.The changes of gene expression in the MCF-7 cells between the 2 groups.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01.圖4 轉(zhuǎn)染前后基因表達(dá)的變化

討 論

基因表達(dá)分析的常用方法包括熒光定量PCR與Northern雜交。熒光定量PCR因操作簡(jiǎn)單、高靈敏度、實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)在基因表達(dá)分析中使用更廣泛，但每個(gè)反應(yīng)只能檢測(cè)單個(gè)基因的缺點(diǎn)限制其在大樣本量、多基因檢測(cè)中的應(yīng)用［9-10］。多基因表達(dá)分析系統(tǒng)是一種全新的基因表達(dá)譜定量分析平臺(tái)，它采用特異性引物和熒光標(biāo)記通用引物共用的方法，既保證高特異性擴(kuò)增又能有效克服傳統(tǒng)PCR因產(chǎn)物和引物差異導(dǎo)致的擴(kuò)增效率不等引起的結(jié)果偏差，從而實(shí)現(xiàn)多重產(chǎn)物定量檢測(cè)的目的［11-12］。

目前有關(guān)survivin-2B促細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制并不清楚，本文利用survivin-2B在乳腺癌細(xì)胞株中過表達(dá)，成功誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期阻滯于G2/M期;同時(shí)利用多重PCR反應(yīng)和熒光定量分析結(jié)合的方法，檢測(cè)21個(gè)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)變化情況，其中8個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，2個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。這些基因編碼的蛋白大多為參與細(xì)胞周期的調(diào)控蛋白以及胞內(nèi)關(guān)鍵信號(hào)通路的節(jié)點(diǎn)蛋白，這些基因表達(dá)的變化與引起細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯有著密切關(guān)系。

以往研究結(jié)果表明，survivin-2B能夠抑制細(xì)胞有絲分裂，誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并且上調(diào)促凋亡因子Bax的表達(dá)，下調(diào)凋亡抑制因子Bcl-2的表達(dá)［13］，有關(guān) survivin-2B下調(diào) Bcl-2表達(dá)的具體機(jī)制并不清楚。根據(jù)GeXP多基因表達(dá)分析系統(tǒng)檢測(cè)基因表達(dá)變化的結(jié)果，我們提出了關(guān)于survivin-2B下調(diào)Bcl-2表達(dá)的一個(gè)可能分子途徑(見結(jié)果部分)。對(duì)于survivin-2B抑制EGLN1表達(dá)的具體分子機(jī)制有待深入研究，我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)survivin-2B與survivin-ΔEx3在細(xì)胞質(zhì)中存在較弱的相互作用［14］，推測(cè) survivin-2B 與 survivin-ΔEx3 可能通過相互結(jié)合形成某種蛋白復(fù)合體而抑制轉(zhuǎn)錄因子與EGLN1基因啟動(dòng)子的有效結(jié)合，從而導(dǎo)致EGLN1的表達(dá)下調(diào)。在細(xì)胞有絲分裂的DNA復(fù)制過程中，DNA聚合酶催化DNA鏈的延伸過程需要復(fù)制因子C(replication factor C，RFC)的參與［15］，本研究發(fā)現(xiàn)survivin-2B誘導(dǎo)RFC的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致DNA復(fù)制過程受到抑制，我們推測(cè)其也許與survivin-2B抑制細(xì)胞有絲分裂及誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯有關(guān)，其具體機(jī)制有待研究。總之，本研究為survivin-2B誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯與細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究提供了有益參考，為進(jìn)一步研究survivin-2B的功能奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Li F，Ambrosini G，Chu EY，et al.Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by surviving［J］.Nature，1998，396(6711):580-584.

［2］ Altieri DC.Survivin，versatile modulation of cell division and apoptosis in cancer［J］.Oncogene，2003，22(53):8581-8589.

［3］ Vegran F，Boidot R，Oudin C，et al.Distinct expression of Survivin splice variants in breast carcinomas［J］.Int J Oncol，2005，27(4):1151-1157.

［4］ Li F，Ling X.Survivin study:an update of“what is the next wave?”［J］.J Cell Physiol，2006，208(3):476-486.

［5］ Li F.Role of survivin and its splice variants in tumorigenesis［J］.Br J Cancer，2005，92(2):212-216.

［6］ Wottawa M，Leisering P，von Ahlen M，et al.Knockdown of prolyl-4-hydroxylase domain 2 inhibits tumor growth of human breast cancer MDA-MB-231 cells by affecting TGF-β1 processing［J］.Int J Cancer，2013，132(12):2787-2798.

［7］ Ginestier C，Hur MH，Charafe-Jauffret E，et al.ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome［J］.Cell Stem Cell，2007，1(5):555-567.

［8］ 丹 令，孫愛軍，王時(shí)俊，等.乙醛脫氫酶2在大鼠心肌缺氧損傷中的抗凋亡作用［J］.中國(guó)病理生理雜志，2006，22(4):683-686.

［9］ Wong ML，Medrano JF.Real-time PCR for mRNA quantitation［J］.Biotechniques，2005，39(1):75-85.

［10］ VanGuilder HD，Vrana KE，F(xiàn)reeman WM.Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis［J］.Biotechniques，2008，44(5):619-626.

［11］ Vansant G，Pezzoli P，Saiz R，et al.Gene expression analysis of troglitazone reveals its impact on multiple pathways in cell culture:a case for in vitro platforms combined with gene expression analysis for early(idiosyncratic)toxicity screening［J］.Int J Toxicol，2006，25(2):85-94.

［12］Chen QR，Vasant G，Oades K，et al.Diagnosis of the small round blue cell tumors using multiplex polymerase chain reaction［J］.J Mol Diagn，2007，9(1):80-88.

［13］Ling X，Cheng Q，Black JD，et al.Forced expression of survivin-2B abrogates mitotic cells and induces mitochondria-dependent apoptosis by blockade of tubulin polymerization and modulation of Bcl-2，Bax，and survivin［J］.J Biol Chem，2007，282(37):27204-27214.

［14］邵紅偉，張文峰，胡青蓮，等.兩種存活蛋白變異剪接體在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)定位及相互作用［J］.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2009，25(12):1131-1136.

［15］ Wood RD，Shivji MK.Which DNA polymerases are used for DNA-repair in eukaryotes? ［J］.Carcinogenesis，1997，18(4):605-610.