王 羿， 柏 帥， 徐旖旎， 江 滟， 陶 玲， 劉興德， 沈祥春△

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是由多種因素導致的、當今世界上威脅人類生命最嚴重的疾病之一。近年來心血管疾病的發(fā)生率呈逐漸增長的趨勢，患者群體呈現(xiàn)出年輕化的趨勢，嚴重威脅著人類的生活質(zhì)量和壽命。高交感活性作為心血管系統(tǒng)疾患的關(guān)鍵因素備受關(guān)注［1］。大量研究證實，氧化應激貫穿于高交感活性誘發(fā)心血管系統(tǒng)疾病的全過程。但是，對高交感活性誘導氧化應激的產(chǎn)生機制，目前存在很大爭議。很多資料認為，兒茶酚胺類物質(zhì)的自身氧化是高交感活性誘導氧化應激的關(guān)鍵因素。本研究以NE復制心肌損傷模型，采用受體阻斷劑系統(tǒng)分析氧化應激產(chǎn)生的根源［2］，為臨床高交感活性誘發(fā)心肌損傷受體依賴性提供新的理論與實驗基礎。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 健康SD大鼠70只，雌雄各半，體重(220±10)g，購自貴陽醫(yī)學院動物實驗中心，動物合格證號為SCXK(黔)2012-001。

1.2 主要儀器 TDL-4ZB臺式自動平衡離心機(湖南星科科學儀器有限公司);BS223S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司);TGLL-18G臺式高速冷凍離心機(太倉市醫(yī)療器械廠);722光柵分光光度計(上海第三分析儀器廠);XW80-A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠)。

1.3 主要試劑 重酒石酸去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)購自河南新宜醫(yī)藥集團精細化工有限公司;鹽酸普萘洛爾(propranolol，Pro)購自上海辛帕斯制藥有限公司;鹽酸哌唑嗪(prazosin，Praz)購自北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限責任公司;維生素E(vitamin E，VE)購自上海信誼延安藥業(yè)有限公司;過氧化物酶(catalase，CAT)、微量丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒和羥脯氨酸試劑盒(堿水解法)購自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 動物的分組與模型復制 為了探測高交感活性誘導心肌損傷的氧化應激與受體調(diào)控的關(guān)系，將實驗分為以下 7 組，即 control、model、Pro、Praz、Pro+Praz、Pro+Praz+VE和VE組，每組10只健康SD大鼠。Control組腹腔注射生理鹽水(normal saline，NS)，其余均腹腔注射 NE 1.5 mg·kg-1，每天2次，連續(xù)腹腔注射16 d［3］復制心肌損傷模型。自造模之日起腹腔注射干預藥物，每天2次，給藥方法見表1。

大鼠均自由飲水進食，環(huán)境溫度為(22±5)℃。末次給藥60 min后，用10%水合氯醛進行麻醉。

2.2 體重變化的測定 注射NE后第3、6、9、12和15天各測1次體重，觀察NE和藥物對大鼠體重的影響。

2.3 心肌重量參數(shù)的測定 大鼠脫頸處死后，迅速開胸取出心臟，表面吸干后，稱心臟重量，在冰冷環(huán)境下剪去心房及右心室后測左心室重量，計算全心指數(shù)及左心指數(shù)。全心指數(shù)=全心重(HW)/體重(BW)，左心指數(shù)=左心室重(LVW)/體重(BW)。

2.4 病理組織學觀察 待左心室稱重完后，取左心室心尖部位一小塊組織于10%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、4 μm厚切片用HE染色、封片，光鏡下觀察心肌病理變化。在BI2000型醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)觀察病理切片的心肌纖維及間隙的變化，并進行拍照。

2.5 左心室MDA、SOD和羥脯氨酸含量檢測 取出大鼠左心室，以10倍量生理鹽水在冰浴下制成10%的心臟勻漿，于4℃、1 000 r/min離心10 min棄去沉淀后，取上清按試劑盒說明測MDA、SOD和羥脯氨酸含量。

2.6 左心室 T-AOC和 CAT、GSH-Px、Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase活性的檢測 心臟勻漿方法同上，取上清按試劑盒說明書的操作步驟測定TAOC 和 CAT、GSH-Px、Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase的活性。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠體重的變化

連續(xù)腹腔注射 NE，第9、12天與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，第15天差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);第9、12、15天動物體重除 Pro+Praz+VE組和VE組外，其余各組動物體重均明顯增加，與模型組比較差異顯著(P＜0.05或 P＜0.01)，見圖 1。

Figure 1.Changes of the body weight of the rats in different groups.Mean±SD.n=10.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group.圖1 各組大鼠體重的變化

2 各種藥物干預對NE誘導的心肌損傷大鼠全心指數(shù)、左心指數(shù)和羥脯氨酸含量的影響

NE(1.5 mg·kg-1)連續(xù)腹腔注射16 d后，模型組的HW/BW與LVW/BW較對照組顯著增加(P＜0.01);各給藥組與模型組比較均明顯降低全心及左心指數(shù)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，Pro+Praz降低效果最明顯，且與Pro比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);模型組羥脯氨酸含量較對照組明顯升高(P＜0.01)，各給藥組羥脯氨酸含量較模型組有所下降(P＜0.01)，但組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 各組大鼠心指數(shù)和羥脯氨酸含量的變化Table 2.Changes of rat heart indexes and the content of hydroxyproline (Mean±SD.n=10)

3 各組大鼠心肌病理組織學的變化

病理組織學檢查結(jié)果顯示，模型組心肌纖維增粗，細胞核有畸形，心肌橫紋尚清，肌原纖維排列較松。采用BI2000型細胞醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)可見模型組細胞間隙增加，心肌纖維排列紊亂等病理特征表現(xiàn)，而給藥各組均具有不同程度的減輕，見圖2。

4 各組大鼠心肌SOD活性和MDA含量的變化

連續(xù)給予NE 16 d后模型組的SOD活性較對照組明顯降低(P＜0.01)，而MDA含量較對照組明顯升高(P＜0.01)，除Pro+Praz+VE組外，各給藥組的SOD活性均明顯升高，與模型組比差異具有統(tǒng)計學意義，組間兩兩比較Pro+Praz組明顯優(yōu)于Pro+Praz+VE組(P＜0.01);Pro+Praz組的MDA明顯低于VE組 (P＜0.05)，見表3。

Figure 2.HE staining of rat myocardial tissues(×400).圖2 大鼠心肌組織HE染色

表3 各組大鼠心肌SOD活力和MDA含量的變化Table 3.Changes of the activity of SOD and content of MDA in the rat myocardium(Mean±SD.n=10)

5 各組大鼠心肌CAT、GSH-Px活性和T-AOC的變化

連續(xù)給予NE 16 d后模型組的CAT、GSH-Px活性和T-AOC較對照組明顯降低(P＜0.01);Praz組、Pro+Praz組、VE組與模型組比較，CAT及GSH-Px活性有顯著差異(P＜0.05或P＜0.01)，Pro+Praz組的GSH-Px活性明顯高于Pro組和Pro+Praz+VE組且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);各給藥組的TAOC較模型組均升高且差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)，其中 Pro+Praz組升高最明顯，與 Pro組和Praz組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表4。

表4 各組大鼠心肌CAT、GSH-Px活性和T-AOC的變化Table 4.Changes of the activity of CAT and GSH-Px，and T-AOC in the rat myocardium［103U/(g protein).Mean ±SD.n=10］

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs control group;△P ＜0.05 vs Pro group;▲P ＜0.05 vs Praz group;○P＜0.05 vs Pro+Praz group.

6 各組大鼠心肌Na+-K+ATPase和Ca2+-Mg2+ATPase活性的變化

連續(xù)給予NE 16 d后，測定Na+-K+ATPase及Ca2+-Mg2+ATPase的活性顯示，模型組較對照組明顯降低，差異顯著(P＜0.01);Praz組和Pro+Praz組的Na+-K+ATPase及 Pro組、Praz組、Pro+Praz組 的Ca2+-Mg2+ATPase活性明顯增加，與模型組比較差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)，Praz組和Pro+Praz組的Na+-K+ATPase活性明顯高于Pro+Praz+VE組(P＜0.05或P＜0.01)，見表5。

表5 各組大鼠心肌Na+-K+ATPase和Ca2+-Mg2+ATPase活性的變化Table 5.Changes of the activity of Na+-K+ATPase and Ca2+-Mg2+ATPase［103U/(g protein).Mean±SD.n=10］

討 論

心肌損傷發(fā)生的機制較為復雜，目前大量研究表明高血壓、冠心病及心肌梗死等疾病過程中，血中兒茶酚胺水平增高，激動α和β受體，使交感活性增強，而長時間的高交感活性可進一步加重心血管疾病［4］。有文獻報道，高交感活性誘發(fā)心血管系統(tǒng)疾病中存在氧化應激。本實驗擬以腎上腺素受體阻斷劑及抗氧化劑之間的系統(tǒng)分析，闡明受體阻斷與氧化應激之間的關(guān)系。

本實驗選采用的Pro是一個非選擇性β受體阻斷劑，Praz是α受體阻斷劑，VE是與氧化應激密切相關(guān)的抗氧化劑。

對各組大鼠體重記錄結(jié)果可以看出，高交感活性可以在一定程度上影響大鼠的生長，而給予受體阻斷劑后，可改善其生長狀況。

雙重阻斷劑組Pro+Praz降低心指數(shù)的效果最明顯，且與Pro+Praz+VE組差異無統(tǒng)計學意義;各給藥組的羥脯氨酸含量與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義，提示阻斷α和β受體能一定程度上降低氧化應激誘導的心肌重構(gòu)。

ROS過量生成和(或)細胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的受損可引起氧化應激，對細胞產(chǎn)生多種毒性作用［5］。體內(nèi)ROS主要包括O2-·、·OH、H2O2等。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量反映脂質(zhì)過氧化損傷的程度。SOD是體內(nèi)一線清除ROS的酶類，SOD可以快速將O2-·轉(zhuǎn)變成為相對活性較低的H2O2，進一步由CTA和GSH-Px降解。T-AOC是抗氧化能力指標;另一方面，適度的氧化應激狀態(tài)可以刺激抗氧化酶的表達［6］。本實驗結(jié)果表明，各給藥組MDA含量均有不同程度降低，其中使用雙重阻斷劑Pro+Praz降低最明顯;抗氧化指標SOD、CAT、GSH-Px及T-AOC的結(jié)果顯示除Pro+Praz+VE組外其余各組均較模型組增高;說明Pro+Praz改善氧化損傷效果最好，提示高交感活性誘導心肌氧化/抗氧化失衡引起的氧化應激損傷與受體是密切相關(guān)的。

心肌Na+-K+ATPase通過分解ATP轉(zhuǎn)運Na+-K+和Na+-Ca2+。Na+-K+ATPase酶活性下降會引起胞內(nèi)Ca2+增加;Ca2+-Mg2+ATPase活性下降主要導致細胞內(nèi)外Ca2+、Mg2+分布失衡，最終引起細胞內(nèi)鈣超載［7］，而Ca2+是一種強解偶聯(lián)劑，可使線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)，造成能量障礙［8］。本實驗結(jié)果證實模型組的ATPase活性較對照組明顯降低且差異有統(tǒng)計學意義，Pro、Praz和Pro+Praz可以明顯改善ATPase的活性。說明高交感活性可通過受體通路引起心肌能量代謝障礙損傷心肌。并且心肌鈣超載、能量代謝障礙可激活心肌重構(gòu)的下游通路，引發(fā)心肌肥厚。實驗結(jié)果提示受體阻斷藥還能從能量代謝途徑改善心肌重構(gòu)。

高交感活性引起心肌氧化損傷的病理發(fā)展過程較復雜，涉及多種因素、多種通道共同參與。本實驗結(jié)果提示，在高交感活性時，NE可通過 α-和β-AR通路引起心肌重構(gòu)、氧化/抗氧化能力失調(diào)、能量障礙，而受體阻斷藥從這3個方面進行干預，證實高交感活性誘導大鼠心肌損傷模型中氧化應激與受體機制密切相關(guān)，這為臨床合理用藥提供了的理論支持與防治策略。

［1］ 趙 智，孫 紅.老年人中樞交感神經(jīng)緊張性增加對心血管系統(tǒng)的影響［J］.生理學研究進展，2007，38(4):379-382.

［2］ Ha?ková P，Koubková L，Vávrová A，et al.Comparison of various iron chelators used in clinical practice as protecting agents against catecholamine induced oxidative injury and cardiotoxicity［J］.Toxicology，2011，289(2-3):122-131.

［3］ Shen XC，Qian ZY.Effects of corcetin on antioxidant enzymatic activities in cardiac hypertrophy induced by norepinephrine in rats［J］.Phrmazie，2006，61(4):348-352.

［4］ Seddon M，Looi YH，Shah AM.Oxidative stress and redox signalling in cardiac hypertrophy and heart failure［J］.Heart，2007，93(8):903-907.

［5］ 鐘 亮，張 睿，紀曉軍，等.胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血損傷后H2O2含量和CAT活性的影響［J］.中國醫(yī)藥科學，2013，3(9):20-22.

［6］ 張 凡，宋少莉，馮 陽，等.2-DG對肺腺癌A549細胞增殖的影響及其相關(guān)機制［J］.腫瘤，2012，32(5):327-331.

［7］ Jiang LP，Wang YY，Zhang CY，et al.Activity of adenosine triphosphatase and the expression of ryanodine receptor 1 mRNA in local tissue of pressure ulcer at early stage in gracilis of rats［J］.Zhonghua Shao Shang Za Zhi，2011，27(3):178-204.

［8］ 趙 斌，王禮春，莊曉東，等.缺氧易化快速起搏引起的心室肌細胞鈣瞬變交替［J］.中國病理生理雜志，2012，28(8):1405-1409.