曾清華 ，饒 慧 ，高潔生

(1．湖南省人民醫(yī)院腎內(nèi)風(fēng)濕免疫科，湖南 長(zhǎng)沙 410006;2．中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

3，5，4’-三甲氧基二苯乙烯(3，5，4'-trimethoxystilbene，BTM)是以白藜蘆醇為原料人工合成的一種新型甲基化衍生物。白藜蘆醇是一種具有多種生物學(xué)活性的非黃酮類(lèi)多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、防治心血管疾病及抗衰老等作用。近年來(lái)其抗炎作用越來(lái)越多地受到重視，然而由于分子中有3個(gè)酚羥基，白藜蘆醇很不穩(wěn)定，極易被氧化，而且血中半衰期短，生物利用度有限，因此限制了其臨床使用效果[1]。BTM的穩(wěn)定性和生物活性較白藜蘆醇均大大增強(qiáng)[2]，但目前對(duì)BTM的研究都主要集中在抗腫瘤方面，關(guān)于其對(duì)炎癥細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道極少。本試驗(yàn)擬以小鼠巨噬細(xì)胞作為BTM作用的靶點(diǎn)，觀察BTM對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞經(jīng)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)后產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及細(xì)胞核因子-κB(NF-κB)活性的影響，探討其抗炎作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、材料與方法

1．1 儀器與材料

超凈工作臺(tái)(ThermoForma MSC)，培養(yǎng)箱(Thermo Forma3111)，倒置顯微鏡(Nikon TMS-F)，光學(xué)顯微鏡(Olympus BX50)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Labsystems Dragon Wellscan MK2)等。RAW264．7 小鼠巨噬細(xì)胞，L929小鼠成纖維細(xì)胞。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0．25%胰酶(均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司);結(jié)晶紫、放線菌素D、LPS(均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司);二甲基亞砜(DMSO)，十二烷基磺酸納(SDS)(均購(gòu)于美國(guó)Amresco公司);兔抗鼠NF-κB多克隆抗體、即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(均購(gòu)于武漢博士德公司);白藜蘆醇、BTM由中南大學(xué)化工學(xué)院合成提供。

1．1 試驗(yàn)方法

1．2．1 對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264．7的處理

調(diào)整 RAW246．7密度為3×105/mL，接種于24孔板，每孔1 mL，同時(shí)放入無(wú)菌蓋玻片，培養(yǎng)24 h后磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗 2 遍，加入濃度分別為 5，10，20，40，80 μmol/L 的 BTM 和白藜蘆醇 1 mL/孔培養(yǎng) 30 min，再加入 10 μg/mL的 LPS 1 mL/孔培養(yǎng)6 h，收集細(xì)胞上清液，檢測(cè)TNF-α的活性，以細(xì)胞爬片檢測(cè)巨噬細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)。以加白藜蘆醇的細(xì)胞作為藥物對(duì)照組，以不加藥物僅加LPS的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組(LPS組)，以不加藥物亦不加LPS的細(xì)胞作為正常對(duì)照組。

1．2．2 L929細(xì)胞結(jié)晶紫染色法檢測(cè)TNF-α的活性

調(diào)整L929細(xì)胞密度為3×105/mL，接種于96孔板，每孔加入100 μL，再加入2 μg/mL的放線菌素D每孔100 μL及各組培養(yǎng)上清液每孔100 μL，以RPMI-1640為對(duì)照組，24 h后棄去上清液，加入0．5%的結(jié)晶紫200 μL染色10 min，用流水洗去結(jié)晶紫，常溫干燥，加 10%SDS100 μL，置于 37 ℃，30 min，混勻后在 490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(OD)值。用細(xì)胞毒百分率表示上清液所含TNF-α的活性，抑制百分率表示藥物對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的抑制程度。細(xì)胞毒百分率(%)=(1-上清液 OD值/對(duì)照 OD值)×100%，抑制百分率(%)=(1-藥物上清液細(xì)胞毒百分率/陰性對(duì)照上清液細(xì)胞毒百分率)×100%。

1．2．3 BTM和白藜蘆醇對(duì)L929細(xì)胞的毒性檢測(cè)

如上方法，在長(zhǎng)滿L929細(xì)胞的96孔板內(nèi)加入不同濃度的BTM和白藜蘆醇，檢測(cè)藥物本身對(duì)L929細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

1．2．4 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)NF-κB的活性

按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，陰性對(duì)照以PBS代替一抗，陰性對(duì)照片僅為背景著色，巨噬細(xì)胞內(nèi)無(wú)棕黃色染色。NF-κB免疫化學(xué)染色結(jié)果判定:細(xì)胞爬片中巨噬細(xì)胞胞核呈棕黑色染色或(和)胞核附近的胞漿呈棕黃色染色為陽(yáng)性細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞率計(jì)算:每張細(xì)胞爬片在光鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)400倍視野，根據(jù)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)比例計(jì)算陽(yáng)性率。陽(yáng)性細(xì)胞率(%)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 BTM和白藜蘆醇對(duì)L929細(xì)胞的毒性檢測(cè)

由表1可見(jiàn)，不同濃度BTM和白藜蘆醇組 OD值與RPMI-1640組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各濃度組藥物本身對(duì)L929細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響，巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液可直接用于測(cè)定TNF-α的活性而不需透析。

表1 藥物和L929細(xì)胞共同培養(yǎng)后的 OD值

2．2 L929細(xì)胞結(jié)晶紫染色法檢測(cè)TNF-α的活性

由表2可見(jiàn)，隨著藥物濃度的增大，細(xì)胞上清液中細(xì)胞毒百分率逐漸下降，藥物的抑制百分率逐漸升高，且BTM的作用強(qiáng)于白藜蘆醇，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。

表2 上清液和L929細(xì)胞共同培養(yǎng)后的結(jié)果

2．3 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)NF-κB的活性

由表3可見(jiàn)，巨噬細(xì)胞經(jīng)白藜蘆醇和BTM處理后各藥物濃度組NF-κB的陽(yáng)性細(xì)胞率與LPS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)，且BTM的作用強(qiáng)于白藜蘆醇。

2．4 藥物濃度、TNF-α活性及NF-κB活性之間的相關(guān)性分析

白藜蘆醇的濃度與巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的細(xì)胞毒百分率及巨噬細(xì)胞爬片中NF-κB的陽(yáng)性細(xì)胞率呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 -0．962和-0．964，P值均為0．002;BTM的濃度與巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的細(xì)胞毒百分率及巨噬細(xì)胞爬片中NF-κB的陽(yáng)性細(xì)胞率亦呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0．876 和 -0．881，P 值分別為 0．022 和 0．020;巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的細(xì)胞毒百分率和巨噬細(xì)胞爬片中NF-κB的細(xì)胞陽(yáng)性率成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0．997，P值為0．000。

3 討論

巨噬細(xì)胞是一種重要的炎性細(xì)胞，可產(chǎn)生TNF-α、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等多種前炎性因子。TNF-α作為主要的炎性細(xì)胞因子，在局部炎性反應(yīng)和組織損傷中均居于重要地位，NF-κB介導(dǎo)許多來(lái)自巨噬細(xì)胞的炎性介質(zhì)的表達(dá)，是TNF-α等基因活化的重要轉(zhuǎn)化因子。白藜蘆醇是一種具有多種生物學(xué)活性的非黃酮類(lèi)多酚化合物，廣泛存在于食用和藥用植物中，是植物為抵抗外來(lái)侵害時(shí)產(chǎn)生的一種植物抗毒素，目前白藜蘆醇對(duì)炎性反應(yīng)的影響在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中研究較多。本研究結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后被激活，產(chǎn)生大量的TNF-α且NF-κB被顯著活化，而將巨噬細(xì)胞與白藜蘆醇共同培養(yǎng)后，LPS刺激的TNF-α的產(chǎn)生和NF-κB的活化都受到不同程度的抑制，顯示白藜蘆醇可以通過(guò)抑制NF-κB的活化從而抑制TNF-α的產(chǎn)生，且呈濃度依賴性，隨著藥物濃度的增高抑制作用逐漸增強(qiáng)。

BTM 是到目前為止發(fā)現(xiàn)的活性最強(qiáng)的白藜蘆醇的甲基化衍生物，為白色無(wú)定形粉末，可溶于乙醇、甲醇、DMSO，不溶于水。目前對(duì)BTM的研究主要集中在抗腫瘤方面。與白藜蘆醇相比，BTM不僅大大提高了生物利用度，而且在保留白藜蘆醇生物藥理特性的基礎(chǔ)上，抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂使細(xì)胞周期停滯及抑制微管蛋白聚合的作用都顯著增強(qiáng)，是白藜蘆醇的100倍[3]。Chabert等[4]利用自己合成的BTM，研究其對(duì)多種不同癌細(xì)胞株的影響，包括人直腸腺癌細(xì)胞(Caco-2)、SW-480(人結(jié)腸腺癌細(xì)胞)、SW-620、SW-480(轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞)、KB(人頭頸部癌細(xì)胞)、TK-6(人淋巴瘤細(xì)胞)等，亦得到與本研究類(lèi)似的結(jié)果，且發(fā)現(xiàn)BTM本身對(duì)細(xì)胞并沒(méi)有直接的細(xì)胞毒作用。Matsuda等[5]研究認(rèn)為，BTM苯環(huán)上的甲氧基對(duì)于藥物的活性很重要，尤其是3位上的甲氧基，證實(shí)了BTM具有抗變應(yīng)性活性，可顯著抑制抗原誘導(dǎo)的RBL-2H3細(xì)胞TNF-α和白細(xì)胞介素-4(IL-4)的釋放。Simoni等[6]用順式BTM作用于人前髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞(HL-60)，發(fā)現(xiàn)BTM可影響整個(gè)細(xì)胞分裂周期，包括G0/G1期、S期及G2/M期，減少各個(gè)時(shí)期的細(xì)胞數(shù)，使凋亡細(xì)胞的比例增加。Seiler等[7]研究順式BTM對(duì)SW-620的作用發(fā)現(xiàn)，其會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞多倍體化，引起MMP-7及tPA等一些蛋白水解酶分泌的增加，但細(xì)胞的侵襲力下降，且侵襲力與藥物濃度成負(fù)相關(guān)。BTM還具有非常強(qiáng)的抗血管生成作用，其抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、膠原質(zhì)侵入和形態(tài)形成等活性是白黎蘆醇的30～100倍，并具有很強(qiáng)的血管靶向性，可顯著引起內(nèi)皮細(xì)胞中的微管分解和微管蛋白解聚[8]。Pan等[9]最近研究顯示，BTM抑制人類(lèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的潛力強(qiáng)于白藜蘆醇，可通過(guò)調(diào)控活性氧類(lèi)(ROS)來(lái)調(diào)節(jié)線粒體的功能并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且ROS在凋亡的早期即已產(chǎn)生，要早于細(xì)胞色素C的釋放、caspase的激活及DNA鏈的斷裂;此外，他們還利用攜帶COLO-205腫瘤的重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠進(jìn)行了體內(nèi)試驗(yàn)，給小鼠腹腔注射質(zhì)量濃度為50 mg/kg的BTM可見(jiàn)顯著的治療效果，觀察到接受治療的腫瘤部位出現(xiàn)了DNA鏈的斷裂和caspase的激活，表明有細(xì)胞凋亡產(chǎn)生，另外還有細(xì)胞分裂周期抑制因子p21蛋白表達(dá)的增加和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白表達(dá)的減少。但關(guān)于BTM對(duì)炎癥細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子的影響，國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道極少。Deng等[10]的研究提示，BTM可能具有比白藜蘆醇更強(qiáng)的抗炎能力。本研究中，通過(guò)觀察BTM對(duì)炎性巨噬細(xì)胞的影響發(fā)現(xiàn)，BTM和白藜蘆醇一樣，亦可抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α的產(chǎn)生和NF-κB的活化，并呈濃度依賴性，隨著藥物濃度的增高抑制作用逐漸增強(qiáng)。因此推斷，BTM亦可通過(guò)抑制NF-κB的活性來(lái)減少TNF-α的產(chǎn)生，而且BTM的抑制作用比白藜蘆醇更強(qiáng)。

[1]汪冬庚．大鼠一次性灌服白藜蘆醇血濃度測(cè)定方法研究[J]．中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004，9(6):646-649．

[2]陳國(guó)良，耿春梅，劉湘水．白藜蘆醇衍生物及類(lèi)似物的研究進(jìn)展[J]．藥學(xué)進(jìn)展，2006，30(4):145-150．

[3]Schneider Y，Chabert P，Stutzmson J，et al．Resveratrol analog(Z)-3，5，4'-trimethoxystilbene is a potent anti-mitotic drug inhibiting tubulin polymerization[J]．Int J Cancer，2003，107(2):189-196．

[4]Chabert P，F(xiàn)ougerousse A，Brouillard R．Anti-mitotic properties of resveratrol analog(Z)-3，5，4’-trimethoxystilbene[J]．BioFactors，2006，27:37-46．

[5]Matsuda H，Tewtrakul S，Morikawa T，et al．Anti-allergic activity of stilbenes from Korean rhubarb(Rheum undulatum L．):structure requirements for inhibition of antigen-induced degranulation and their effects on the release of TNF-alpha and IL-4 in RBL-2H3 cells[J]．Bioorg Med Chem，2004，12(18):4 871-4 876．

[6]Simoni D，Roberti M，Invidiata FP，et al．Stilbene-based anticancer agents:resveratrol analogues active toward HL60 leukemic cells with a non-specific phase mechanism[J]．Bioorg Med Chem Lett，2006，16(12):3 245-3 248．

[7]Seiler N，Schneider Y，Gosse F，et al．Polyploidisation of metastatic colon carcinoma cells by microtubule and tubulin interacting drugs:Effect on protelytic activity and invasiveness[J]．International Journal of Oncology，2004，25:1 039-1 048．

[8]Belleri M，Ribatti D，Nicoli S，et al．Antiangiogenic and vascular-targeting activity of the microtubule-destabilizing trans-resveratrol derivative 3，5，4'-trimethoxystilbene[J]．Mal Pharmacol，2005，67(5):1 451-1 459．

[9]Pan MH，Gao JH，Lai CS，et al．Antitumor activity of 3，5，4'-trimethoxystilbene in COLO 205 cells and xenografts in SCID mice[J]．Mol Carcinog，2008，47(3):184-196．

[10]Deng YH，Alex D，Huang HQ，et al．Inhibition of TNF- α -mediated endothelial cell-monocyte cell adhesion and adhesion molecules expression by the resveratrol derivative，trans-3，5，4'-trimethoxystilbene[J]．Phytother Res，2011，25(3):451-457．