謝蔓菁，陳文霞，黃 楊，李康婧

(廣西醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，廣西南寧 530021)

牙髓組織對于維持牙齒作為一個有活力組織器官的內(nèi)部穩(wěn)態(tài)起著關鍵性作用。臨床上對不可逆性牙髓炎的治療通常采用根管治療術，但根管治療后的牙齒由于失去牙髓的營養(yǎng)來源，常存在脆性變大、容易折裂等問題［1－2］。近年來，關于牙髓再生的研究已成為國內(nèi)外學者關注的焦點，并利用干細胞移植技術在體內(nèi)外成功構(gòu)建出牙髓牙本質(zhì)復合體樣結(jié)構(gòu)。然而，干細胞移植存在一定的風險，有研究發(fā)現(xiàn)體外擴增的間充質(zhì)干細胞在動物移植模型中可引起腫瘤的發(fā)生［3－4］。細胞遷移是損傷修復的前提，而生長因子則在干細胞的遷移、增殖、分化過程中起到重要作用。

BMSCs是存在于骨髓中的一類成體干細胞，具有多向分化的潛能，且細胞生物學特性與牙源性干細胞有諸多相似之處［5］。有研究證實，BMSCs在適宜的微環(huán)境中可被誘導分化為成牙本質(zhì)樣細胞［6］。有文獻報道，在富血小板血漿中加入激活劑后可形成一種膠凍狀的半固體，即富血小板血漿凝膠(Platelet richplasmagel，PRG)，其主要結(jié)構(gòu)為纖維蛋白網(wǎng)和血小板［7］。另有研究發(fā)現(xiàn)，在PRP形成PRG過程中，血小板可通過脫顆粒作用，釋放出多種對細胞趨化、增殖、多向分化起促進作用的生長因子［8］。本實驗通過觀察不同濃度PRG析出液作用不同時間對BMSCs遷移的促進作用，以期為后續(xù)研究中利用PRG析出液趨化種子細胞進入根管介導牙髓再生奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

CO2孵育箱(Thermo，美國);相差顯微鏡及其照相系統(tǒng) (Olympus，日本);高溫低速離心機(Sigma，美國);全自動血細胞分析儀(深圳);細胞培養(yǎng)皿、板(Corning，美國);Transwell培養(yǎng)小室(Millipore，美國);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone，美國);2.5g/L EDTA－胰蛋白酶(北京索萊寶);牛凝血酶(Sigma，美國)。

1.2 犬BMSCs的分離培養(yǎng)及其成骨分化鑒定

1.2.1 犬BMSCs分離培養(yǎng)

取6個月家犬1只(體質(zhì)量約為4 kg)，在戊巴比妥鈉腹腔注射(30 mg/kg)麻醉下，自脛骨上端穿刺抽取骨髓置于含肝素的試管中，加入等體積PBS并充分混合后，室溫下離心(1000 r/min)15 min;沉淀部分用DMEM完全培養(yǎng)液重懸后接種于25 mL培養(yǎng)瓶，置于37℃培養(yǎng)箱中在50 mL/L CO2飽和濕度下培養(yǎng)。當細胞生長接近80%融合時，按1∶3進行首次傳代，隔日換液;待細胞生長達80% ～90%融合時再次傳代。

1.2.2 犬BMSCs成骨分化鑒定

取第3代BMSCs按1×106/mL的細胞濃度接種于成骨誘導條件培養(yǎng)基(1 mmol/L地塞米松、1 mol/L β－甘油磷酸鈉、50 mmol/L抗壞血酸)，37℃，50 mL/L CO2飽和濕度下進行培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)3周后，分別進行堿性磷酸酶、茜素紅、Von kossa染色，倒置顯微鏡下觀察BMSCs經(jīng)過成骨誘導后堿性磷酸酶的表達以及鈣結(jié)節(jié)形成情況。

1.3 PRG析出液的制備

1.3.1 PRP 提取

取上述同一只實驗犬并以相同的方法麻醉后，無菌條件下采集靜脈血，用低溫高速離心機在控溫20℃條件下兩次離心:第1次離心(2400 r/min，10 min)后，在超凈工作臺內(nèi)分別吸取全部血漿層、白膜層及其下2～3 mm的紅細胞層，并移入另一無菌離心管內(nèi)進行第2次離心(3600 r/min，15 min)，吸棄上層3/4貧血小板血漿，將余下的1/4血漿層、白膜層以及紅細胞層混勻后即為PRP。然后立即對全血及PRP進行血小板計數(shù)。

1.3.2 制備PRG析出液

將PRP與激活劑(牛血酶及10%CaCl2混合物)按體積比為9∶1的比例混合，震蕩混勻后室溫下靜置1 h，再置于4℃冰箱過夜。待PRP凝膠大部分收縮后，以5000 r/min速度離心10 min，并吸取富含復合生長因子的PRG析出液分裝于1.5 mL EP管內(nèi)，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 BMSCs遷移實驗

1.4.1 觀察PRG析出液對BMSCs遷移影響的濃度效應

取第3代BMSCs接種于無血清培養(yǎng)基進行饑餓培養(yǎng)8 h后，用DMEM培養(yǎng)液制備細胞密度為1×106/mL的單細胞懸液。取帶有Transwell小室的24孔板，并于每個小室的上室內(nèi)各加入100 mL BMSCs單細胞懸液，然后將其隨機分為6組(5個實驗組和1個對照組)(每組復3孔);然后在5個實驗組的下室內(nèi)分別加入含PRG析出液體積分數(shù)為1%、5%、10%、20%、50%的DMEM培養(yǎng)液(含1%血清)600 μL，對照組加入等量僅含1%血清的DMEM培養(yǎng)液標準環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，取出各組所有Transwell小室，棄去上室培養(yǎng)液并用PBS浸洗2 min;棉簽輕柔拭去小室濾膜內(nèi)表面未遷移的細胞后，將外表面遷移有細胞的濾膜置于40 g/L多聚甲醛溶液條件下固定10 min;然后蒸餾水洗滌3 min×2次，10 g/L結(jié)晶紫染色10 min;蒸餾水漂洗5 min后自然晾干，顯微鏡下觀察穿膜細胞，并于每張濾膜上各隨機選取5個視野(100×)計算穿膜細胞數(shù)，取其平均值［9］。重復3次。

1.4.2 觀察PRG析出液對BMSCs遷移影響的時間效應

取3塊帶有Transwell小室的24孔板，并于每個Transwell小室的上室內(nèi)各加入100 μL第3代BMSCs單細胞懸液(制備方法和細胞密度同1.4.1)，并將其隨機分為兩組:實驗組下室內(nèi)加入含PRG析出液濃度為5%的DMEM培養(yǎng)液(含1%血清)600 μL;對照組下室內(nèi)加入等量僅含1%血清的DMEM培養(yǎng)液。標準環(huán)境內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后12、24、36 h各時間點，每組各取出3個Transwell小室，按1.4.1相同的方法進行細胞固定、染色和顯微鏡下觀察，并對穿膜細胞進行計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)學觀察

BMSCs原代培養(yǎng)第5天時，貼壁細胞散在分布于培養(yǎng)瓶底部，并呈圓形、多角形、梭形外觀(圖1a);培養(yǎng)10～12 d后，細胞融合成片，基本貼滿培養(yǎng)瓶底部。傳代培養(yǎng)后，細胞形態(tài)逐漸趨于一致，排列規(guī)律有序，呈放射狀或漩渦樣生長，增殖速度較原代細胞快(圖1b)。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)學觀察(×40)

2.2 BMSCs成骨分化鑒定結(jié)果

BMSCs成骨誘導3周后堿性磷酸酶染色可見細胞膜及胞漿內(nèi)均有陽性反應，染色呈藍黑色顆粒或塊狀深染顆粒(圖2a);茜素紅染色可見染色陽性的桔紅色鈣結(jié)節(jié)(圖2b);Von kossa染色可見染色陽性的黑色鈣結(jié)節(jié)(圖2c)。

2.3 PRP中血小板含量及PRG析出液的含量

二次離心所得PRP中血小板的含量為(953.33±64.53)×109/L，全血中血小板的含量為(208.66±13.57)×109/L，與全血相比，PRP 中血小板濃度明顯升高(P＜0.05)。10 mL靜脈全血制備的 PRP約可制備出0.7 mL的 PRG析出液(圖3)。

圖2 BMSCs成骨分化鑒定結(jié)果(×40)

2.4 不同濃度PRG析出液對BMSCs遷移的影響

與對照組相比，1%、5%、10%、20%不同濃度PRG析出液均能明顯促進BMSCs的遷移(P＜0.05);其中以5%濃度組的促進作用最強;此后隨著PRG析出液濃度的升高，對BMSCs遷移的促進作用逐漸降低，當其濃度達50%時，小室濾膜外表面已觀察不到穿膜細胞;不同濃度PRG析出液組遷移細胞數(shù)量兩兩相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)(表1，圖 4)。

圖3 富血小板血漿凝膠析出液的制備

表1 各組BMSCs的遷移數(shù)比較 (n=3)

2.5 5%PRG析出液促進BMSCs遷移的時間效應

與對照組相比，5%PRG析出液作用于BMSCs 12、24、36 h不同時間均能明顯促進其遷移(P＜0.05);實驗組不同時間點的遷移細胞數(shù)以12 h最低，與24、36 h組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);作用24 h的遷移細胞數(shù)最高，但與36 h相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(圖5，表2)。

圖4 不同濃度PRG析出液組的BMSCs遷移情況(×100)

圖5 5%PRG析出液作用于BMSCs不同時間后的細胞遷移情況(×40)

表2 5%PRG析出液促進BMSCs遷移的時間效應

3 討論

Dimitris等(1984)發(fā)現(xiàn)血漿中提取的PRP經(jīng)激活后可使其中的血小板釋放出多種生長因子以來，學者們對PRP的成分、生物學作用以及臨床應用等均進行了大量研究;并發(fā)現(xiàn)其含有機體損傷修復所需的多種生長因子，如血小板衍生生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF－β)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)等［10］。Garg等［11］報道，在 PRP中加入促凝劑后，不僅可激活血小板使之釋放生長因子，同時還能激活纖維蛋白使其形成具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，該凝膠的特殊結(jié)構(gòu)有利于細胞黏附、增殖、分化，更能充分發(fā)揮其生物學作用。

本研究通過Transwell實驗觀察了PRP激活后形成的凝膠析出液對BMSCs遷移的促進作用，結(jié)果顯示:培養(yǎng)基中的PRG析出液濃度在1%～20%時，可明顯促進BMSCs的遷移，其中以5%濃度組的促進遷移作用最佳;此后隨著PRG析出液濃度的增加促進遷移作用越來越低，當濃度達到50%時，已觀察不到遷移的細胞。本結(jié)果與相關研究類似，Marx等［12］認為，PRP內(nèi)的血小板濃度為全血血小板濃度的4～5倍時，才會有明顯的生物學作用，低于此范圍，其作用不顯著;高于此范圍，其作用也不會得到增強，甚至會起到抑制遷移的作用。Weibrich等［13］在研究PRP中的血小板濃度對種植體周圍骨再生的作用時發(fā)現(xiàn)，當PRP內(nèi)血小板的濃度為全血血小板濃度的2～6倍時，才會對種植體周圍骨再生起到明顯的促進作用，而當其濃度為6～11倍時，則會對成骨細胞的活性起抑制作用;作者在分析引起這一現(xiàn)象的原因時認為，當其濃度過高時細胞因子可能會表現(xiàn)出細胞毒性所致。此外，Marden［14］也報道了高劑量的 PDGF－BB 能抑制骨生成。分析其原因:①細胞遷移運動的發(fā)生是由析出液中生長因子配體與細胞膜上相應受體結(jié)合后所啟動，但細胞膜上的受體數(shù)量有限，當生長因子濃度升高到一定程度時，受體與配體數(shù)量恰好匹配，即能發(fā)揮最佳促遷移效果，若超過該濃度閾值時，則會出現(xiàn)受體飽和反饋抑制，從而導致遷移細胞數(shù)逐漸降低甚至觀察不到細胞的遷移;②當PRG析出液的濃度過大時，其中所含有的高濃度生長因子會表現(xiàn)出細胞中毒，從而導致細胞凋亡，使之無法遷移小室的濾膜外表面。此外，本實驗中還發(fā)現(xiàn)，PRG析出液對BMSCs的遷移作用具有時間依賴性，即5%的 PRG析出液作用于 BMSCs 24 h組的促遷移作用最佳，但其具體機制尚有待于進一步研究。

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