王 棟，王永祿，葉 雯，呂貝貝，韓 杰，高天嬰，李學明（南京工業(yè)大學藥學院，南京 211816）

非諾貝特（fenofibrate）為第三代氯貝丁酯類降血脂藥物，經(jīng)口服吸收后，被體內(nèi)脂酶水解后變成活性產(chǎn)物非諾貝酸而起效［1］，是臨床上常用的降脂調(diào)脂藥物之一。非諾貝特在水中幾乎不溶，所以口服吸收差，生 物 利 用 度 低［2］。 納 米 混 懸 劑 （nanosuspensions）是適用于難溶性藥物的新劑型，系將藥物顆粒粉碎到納米級后懸浮于分散介質(zhì)中，從而增加藥物的溶出速率，提高生物利用度［3］。本實驗采用大鼠在體腸循環(huán)結(jié)合頸動脈取血的方法，更真實地模擬了正常的生理條件，研究了非諾貝特納米混懸劑的在體腸吸收情況，并根據(jù)藥時曲線計算其藥動學參數(shù)，以求更全面深入地揭示非諾貝特納米混懸劑在體內(nèi)的腸吸收過程。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（日本島津制作所，LC－20AT、SPD－20A）；紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司，TU－1901型）；恒流蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司，BT00－300M型）；電子分析天平（德國賽多利斯股份公司，BP211D型）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司，HH－4型）；醫(yī)用低速離心機（金壇市正基儀器有限公司，80－2型）；微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠，WH－2型）；高壓均質(zhì)機（意大利 GEA Niro Soavi公司，NS1001L2K）；納米粒度分析儀（英國 Malvern儀器有限公司，3000HS）；高剪切乳化器（上海弗魯克流體機械制造有限公司）；恒溫磁力攪拌器（金壇市精達儀器制造廠）。

1.2 試藥 非諾貝特原料藥及對照品、非諾貝酸對照品均由徐州恩華藥業(yè)公司提供；非諾貝特納米混懸劑為自制，批號20110820；氯貝酸由上海安譜科學儀器有限公司提供，批號C11480000；泊洛沙姆188由南京威爾化工有限公司提供；PVP K30購自上?；瘜W試劑公司；吐溫80購自上海凌峰化學試劑有限公司；酚紅購自南京奧多福尼生物科技有限公司；其余化學試劑均為分析純；三蒸水為自制。

1.3 動物 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量為250g左右，共6只。動物許可證號：SCXK（滬）2011－2010。

2 方法與結(jié)果

2.1 非諾貝特納米混懸劑的制備 將PVP K30和泊洛沙姆188溶于三蒸水中，加入非諾貝特適量，于85℃水浴中加熱至熔融狀態(tài)，再用高剪切乳化器以10 000r·min－1轉(zhuǎn)速乳化3min，置于高壓均質(zhì)機中，以300和500bar循環(huán)3次，再以800bar循環(huán)12次，將得到的樣品置于冰浴中，迅速冷卻固化，即得到非諾貝特納米混懸劑［4］。

2.2 腸循環(huán)液中酚紅、非諾貝特及非諾貝酸的含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；預(yù)柱：DIKMA（C18，10mm×4.6mm）；流動相：甲醇－水（80∶20），用磷酸調(diào)pH 至3.0；柱溫：25℃；檢測波長：286nm；流速：1.0mL·min－1；進樣量：20μL［5］。

2.2.2 溶液的配制 （1）Krebs－Ringer試液（pH 7.4，簡稱K－R試液）稱取氯化鈉7.8g、氯化鉀0.35g、無水氯化鎂0.02g、無水氯化鈣0.37g、磷酸二氫鈉0.32g、碳酸氫鈉1.37g、葡萄糖1.4g，加三蒸水溶解并稀釋至1L，即得。

（2）非諾貝特對照溶液 取非諾貝特對照品50mg，精密稱定，置于100mL量瓶中，加無水乙醇溶解稀釋至刻度，作為儲備液；精密移取儲備液20mL，置于100mL量瓶中，加0.1g·mL－1的吐溫80溶液5mL，用K－R試液稀釋至刻度。

（3）非諾貝酸對照溶液 取非諾貝酸對照品10mg，精密稱定，置于100mL量瓶中，用K－R試液溶解并稀釋至刻度，作為儲備液；精密量取5mL，置于50mL量瓶中，加K－R試液稀釋至刻度。

（4）混合對照液 精密量取非諾貝特儲備液50mL、非諾貝酸儲備液10mL，置于100mL量瓶中，精密加入0.1g·mL－1的吐溫80溶液5mL，用K－R試液稀釋刻度。

（5）空白腸循環(huán)液 取酚紅30mg，精密稱定，再稱取2.2.1中各物質(zhì)，加乙醇50mL及0.1g·mL－1的吐溫80溶液50mL，用三蒸水溶解并稀釋至1L。將配制好的溶液在體循環(huán)4h，中止實驗，即得空白腸循環(huán)液。

（6）腸循環(huán)供試液 精密量取非諾貝特納米混懸液適量，用空白腸循環(huán)液稀釋至含非諾貝特約100μg·mL－1的溶液，在體循環(huán)4h后中止，即得腸循環(huán)供試液。

2.2.3 酚紅標準曲線的制備 取酚紅10mg，精密稱定，置于100mL量瓶中，用K－R試液溶解并稀釋至刻度，作為儲備液。精密移取酚紅儲備液0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35和0.4mL，置于10mL 量瓶中，用0.01mol·L－1氫氧化鈉溶液稀釋至刻度，作為標準工作溶液。取上述標準工作溶液，以0.01mol·L－1氫氧化鈉溶液為空白，于558nm測定吸光度，以吸光度A為縱坐標、酚紅質(zhì)量濃度C（μg·mL－1）為橫坐標進行線性回歸，回歸方程：A＝0.197 9C＋0.003 9，r＝0.999 3（n＝5）。

2.2.4 非諾貝特及非諾貝酸含量測定方法 取供試溶液5mL，以10 000r·min－1離心5min，取上清液1mL，置于10mL量瓶中，加0.01mol·L－1氫氧化鈉溶液稀釋至刻度，作為待測溶液，以0.01mol·L－1氫氧化鈉溶液為空白，于558nm測定吸光度，根據(jù)外標法計算酚紅質(zhì)量濃度。另取適量上清液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，在2.2.1條件下進樣測定，記錄色譜圖，按外標法計算腸循環(huán)液中非諾貝特和非諾貝酸的質(zhì)量濃度。

2.2.5 方法專屬性 分別取2.2.2項下（1）～（6）溶液，在2.2.1條件下注入液相色譜儀，記錄色譜圖，如圖1。結(jié)果顯示，腸循環(huán)樣品液中非諾貝酸、非諾貝特的保留時間與對照品的一致，分別為5.3和12.8min。其他成分在色譜條件下不干擾測定。

圖1 非諾貝特、非諾貝酸HPLC測定色譜圖A.陰性對照液；B.非諾貝特對照液；C.非諾貝酸對照液；D.混合對照液；E.空白腸循環(huán)液；F.腸循環(huán)樣品液；1.非諾貝酸；2.非諾貝特Fig.1 HPLC chromatograms for fenofibrate and fenofibric acidA.negative sample；B.fenofibrate reference solution；C.fenofibric acid reference solution；D.reference solution with fenofibrate and fenofibric acid；E.blank circumfusion solution；F.circumfusion solution；1.fenofibric acid；2.fenofibrate

2.2.6 線性 分別精密量取混合對照液0.01，0.1，0.5，2.5和5mL，置于10mL量瓶中，分別用 K－R試液稀釋至刻度，作為標準工作溶液。取上述標準工作溶液，在2.2.1條件下進樣，以色譜峰面積A為縱坐標、溶液質(zhì)量濃度C為橫坐標進行線性回歸。結(jié)果顯示，非諾貝特的回歸方程為：A＝63 218C－2 844，r＝0.999（n＝5），線性范圍為0.25～124.68μg·mL－1；非諾貝酸的回歸方程為：A＝90 819C－501.25，r＝0.999 9（n＝5），線性范圍為0.01～5.05μg·mL－1；表明二者線性均良好。

2.2.7 最低檢測限考察 分別取非諾貝特對照液、非諾貝酸對照溶液逐步稀釋，進樣測定，以信噪比約為3∶1作為檢測限，得非諾貝特及非諾貝酸的最低檢測質(zhì)量濃度分別為10.0和1.01ng·mL－1。

2.2.8 精密度 取2.2.6項下非諾貝特質(zhì)量濃度為0.25，12.47和124.68μg·mL－1的3份混合溶液，在2.2.1條件下分別連續(xù)進樣5次，記錄色譜圖，結(jié)果3種質(zhì)量濃度下非諾貝特峰面積RSD分別為0.31%，0.05%和0.03%，非諾貝酸峰面積 RSD分別為0.84%，0.15%和0.04%。另取上述溶液置于冰箱中保存，分別在1，2，3，4和5d取樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果3種質(zhì)量濃度下非諾貝特峰面積RSD分別為0.99%，0.16%和0.10%，非諾貝酸峰面積RSD分別為2.13%，0.33%和0.12%。實驗結(jié)果表明方法日內(nèi)和日間精密度均良好。

2.2.9 回收率 取混合對照品溶液1，2和3mL，分別置于10mL量瓶中，用K－R試液稀釋至刻度，作為不同質(zhì)量濃度的供試溶液。在2.2.1項條件下進行測定，記錄色譜圖，分別計算非諾貝特與非諾貝酸的回收率。結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明方法回收率良好。

2.2.10 穩(wěn)定性考察 將混合對照液置于37℃水浴中，放置4h后取出，用K－R試液稀釋后在2.2.1項條件下測定，比較放置前后藥物含量變化，結(jié)果放置后非諾貝特含量為放置前的98.24%，非諾貝酸含量為放置前的99.97%。實驗結(jié)果表明在K－R試液中2種物質(zhì)的穩(wěn)定性均良好。

2.3 血漿藥物質(zhì)量濃度測定方法的建立

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；預(yù)柱：DIKMA（C18，10mm×4.6mm）；流動相：甲醇－水（75∶25），磷酸調(diào)pH 至3.0；柱溫：25℃；檢測波長：286nm；流速：1.0mL·min－1；進樣量：50μL。

2.3.2 血漿樣品測定方法 取血漿樣品100μL，置于1.5mL離心管中，加內(nèi)標溶液50μL（100μg·mL－1的氯貝酸甲醇溶液），渦旋30s，再加入200μL蛋白沉淀劑（乙腈與1mol·L－1鹽酸以95∶5配制而成），渦旋30s，再以12 000r·min－1轉(zhuǎn)速離心處理15min，取上清液作為供試溶液，照2.3.1項下色譜條件測定。

2.3.3 方法專屬性 分別配制空白血漿、空白血漿加內(nèi)標、空白血漿加非諾貝酸以及大鼠體內(nèi)給藥后血樣的供試溶液，在2.3.1條件下檢測，結(jié)果如圖2所示。

表1 回收率實驗結(jié)果Tab.1 The result of recovery test

圖2 方法專屬性驗證液相色譜圖A.空白血漿；B.內(nèi)標；C.非諾貝酸；D.動物給藥血樣Fig.2 HPLC chromatograms of plasma to verify the method specificityA.plasma blank；B.the internal standard；C.fenofibric acid；D.blood sample

由圖2可見，內(nèi)標（氯貝酸）的保留時間約為4.9min，非諾貝酸的保留時間約為8.5min。色譜峰峰形良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾非諾貝酸的含量測定。

2.3.4 線性 取非諾貝酸對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度約為20和200μg·mL－1的儲備液 A 和 B，分別移取儲備液 A 0.2，0.4，1和2mL，儲備液B 0.4，1，1.5和2mL，置于10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度；分別取上述溶液50μL，用氮氣吹干后加入空白血漿樣品100μL，渦旋30s，照2.3.2處理得到血藥質(zhì)量濃度分別為0.2，0.4，1，2，4，10，15和20μg·mL－1的標準溶液；取上述溶液，在2.3.1條件下進行測定，記錄色譜圖，以非諾貝酸峰面積Ai與內(nèi)標峰峰面積As之比Ai／As對血漿非諾貝酸質(zhì)量濃度C（μg·mL－1）進行線性回歸，得回歸方程：A＝0.210 5C＋0.027 8，r＝0.999 9（n＝8），表明非諾貝酸血藥質(zhì)量濃度與峰面積在2～80μg·mL－1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 最低檢測質(zhì)量濃度 精密移取空白血漿100μL，向其中加入不同質(zhì)量濃度非諾貝酸對照溶液，照2.3.2進行處理并測定，以信噪比約為3作為檢測限，結(jié)果表明最低檢測限為200ng·mL－1。

2.3.6 精密度 日內(nèi)精密度 按2.3.2項下方法平行制備5份質(zhì)量濃度為0.4，4和15μg·mL－1的樣品溶液，并于同日測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示3個質(zhì)量濃度下血漿中非諾貝酸RSD值分別為6.41%，1.1%和0.16%，表明其日內(nèi)精密度良好。

日間精密度 取日內(nèi)精密度項下供試溶液，分別在1，2，3，4和5d取樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，5d內(nèi)非諾貝酸的RSD分別為4.65%，1.12%和0.2%，其日間精密度良好。

2.3.7 凍融穩(wěn)定性實驗 取2.3.4項下質(zhì)量濃度為0.4，4和15μg·mL－1的樣品溶液，置于－80℃冰箱冷藏1周，取出，用37℃水浴解凍后，測定其血藥質(zhì)量濃度，并將結(jié)果與室溫放置的樣品進行比較。結(jié)果見表2。由表2可知，在室溫下以及在冰箱內(nèi)冷凍保存后再復(fù)融的3種質(zhì)量濃度的非諾貝酸血漿樣品測定值RSD均小于5%，表明在冷凍條件下，大鼠待測血漿樣品較為穩(wěn)定，因此，待測血漿樣品在冷凍條件下保存1周不會影響實驗測定結(jié)果的準確性。

表2 凍融過程對含量測定的影響Tab.2 Stability of plasma samples in freezing conditions（n＝3）

2.4 大鼠在體腸循環(huán)結(jié)合頸動脈取血實驗

2.4.1 實驗方法 實驗前大鼠禁食24h，稱體質(zhì)量后，于腹腔注射烏拉坦溶液（0.01mL·g－1）麻醉固定，在頸動脈處做好取血準備。沿腹中線打開腹腔（切口約2.5cm長），找出并結(jié)扎膽管，于實驗?zāi)c段兩端各切一小口，在切口處分別插入玻璃管并扎緊。用注射器從上切口處緩緩注入37℃的生理鹽水清洗腸管至凈。再將腸管兩端的玻璃管與蠕動泵連接形成回路。用蠕動泵將供試液以5mL·min－1流速循環(huán)10min后，調(diào)節(jié)流速為2.5mL·min－1，并立即自供試液錐形瓶中取樣5mL，作為測定零時刻腸循環(huán)液樣品，并向錐形瓶中補加酚紅液5mL。同時，從大鼠頸動脈取血1mL，置于肝素化刻度離心管中，其后每隔30min亦按同法取腸循環(huán)液（補加酚紅KR液）和血樣，循環(huán)4h后，中止實驗。腸循環(huán)樣品照2.2.4進行測定，結(jié)果以酚紅為參比進行校正，血樣照2.3.2方法處理后測定。實驗結(jié)果如表3所示。

由表3數(shù)據(jù)可知，隨著腸腔中藥物含量的逐漸減少，血中藥物質(zhì)量濃度逐漸升高，從而印證了體外循環(huán)液中藥物的消失是因為吸收入血的結(jié)果。

表3 大鼠在體腸循環(huán)結(jié)合頸動脈取血中腸內(nèi)藥物減少量及血藥質(zhì)量濃度Tab.3 The reductions in the intestine and the concentration in plasma of fenofibrate

2.4.2 大鼠腸腔內(nèi)藥物減少量與血藥質(zhì)量濃度的相關(guān)性 以大鼠在體腸循環(huán)結(jié)合頸動脈取血實驗中的腸腔內(nèi)藥物累計減少量為自變量（x）、血藥質(zhì)量濃度為因變量（y），進行線性回歸，線性方程：y＝7×10－5x

＋0.521 9，r＝0.993 6。

3 討論

3.1 血漿藥物濃度檢測方法 本實驗參照有關(guān)文獻建立了大鼠血漿中非諾貝特降解活性代謝物非諾貝酸的HPLC檢測方法，血漿中內(nèi)源物質(zhì)不干擾非諾貝酸的含量測定，方法簡單快捷，專屬性強。大鼠血漿中藥物線性關(guān)系良好（r＝0.997 5，n＝8），準確度在90%～110%之間，日間和日內(nèi)精密度小于10%，最低檢測限為100ng·mL－1，凍融實驗符合要求，該方法能夠滿足血漿樣品中非諾貝酸的測定要求。

3.2 動物體內(nèi)吸收的研究方法 本課題中所采用的動物實驗方法為改良的腸襻法，傳統(tǒng)的腸襻法是將大鼠的腸腔結(jié)扎，有時需要做部位研究時，也可以分段結(jié)扎腸腔。將藥物溶液注入到腸襻中，經(jīng)過一定時間的吸收后，取出腸襻，收集沖洗腸腔內(nèi)腸液，測定剩余的藥物量［6］。根據(jù)藥物的減少量來了解藥物在腸腔的吸收情況。腸襻法可以考察藥物的吸收情況和部位差異，以及促進劑的促吸收效果，在實驗過程中避免破壞血液供應(yīng)和淋巴流。

在體腸循環(huán)法雖然與正常的生理條件最為接近，但是實驗手術(shù)對大鼠生理特征的改變必定會影響正常的藥物體內(nèi)行為。此外，在操作過程中，麻醉、背位固定的方式及連續(xù)取血等操作也經(jīng)常會加速大鼠的死亡，影響血樣的正常采集和數(shù)據(jù)的完整。

鑒于體內(nèi)血藥質(zhì)量濃度測定與在體腸灌注法研究藥物體內(nèi)吸收均存在各自的優(yōu)缺點，本課題采用兩種方法相結(jié)合的方式，同時研究非諾貝特納米混懸劑在大鼠體內(nèi)的腸吸收與體內(nèi)藥動學過程，以求更全面深入地揭示非諾貝特納米混懸劑的體內(nèi)吸收過程。實驗結(jié)果表明，大鼠在體腸循環(huán)實驗與動物整體的藥物吸收程度有較好的相關(guān)性，血藥質(zhì)量濃度與腸腔中藥物減少量在相應(yīng)的各個時間點分別相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r＝0.993 6，可以判定兩者為點對點相關(guān)，相關(guān)水平最高，此時腸吸收藥量可以直接反映藥物吸收入血的程度［7］，提示在體腸循環(huán)模型可用于非諾貝特納米混懸劑的處方優(yōu)化，預(yù)測非諾貝特的體內(nèi)吸收情況。

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