祝立麗, 肖明明, 表貞淑, 劉 洋, 李正剛, 楊 锎, 李銀玲, 高 爽, 景士兵

實(shí)驗(yàn)研究

皮膚鱗狀細(xì)胞癌中Survivin, Caspase-3, COX-2的表達(dá)及臨床意義

祝立麗, 肖明明, 表貞淑, 劉 洋, 李正剛, 楊 锎, 李銀玲, 高 爽, 景士兵

目的探討皮膚鱗狀細(xì)胞癌及癌旁正常皮膚中Survivin, Caspase-3和COX-2 的表達(dá)及臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)法和熒光實(shí)時(shí)定量PCR，檢測41例鱗狀細(xì)胞癌及10例癌旁正常皮膚組織中Survivin, Caspase-3和COX-2 蛋白及mRNA表達(dá)情況。結(jié)果癌旁正常皮膚中Survivin, Caspase-3和COX-2 蛋白的陽性表達(dá)率分別是0、90.00%、10.00%，鱗狀細(xì)胞癌中陽性表達(dá)率分別是68.29%、29.27%、73.17%。與癌旁正常皮膚相比，鱗狀細(xì)胞癌中Survivin, Caspase-3和COX-2 mRNA相對表達(dá)量為11.21、0.13、9.85，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)相關(guān)性分析，鱗狀細(xì)胞癌中Survivin與Caspase-3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(χ2=11.994,P=0.001,R=-0.598)；Survivin和COX-2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(χ2=14.415,P=0,R=0.652)。結(jié)論Survivin, Caspase-3和COX-2蛋白可能參與皮膚鱗狀細(xì)胞癌的形成；Survivin和COX-2蛋白協(xié)同促進(jìn)鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展；增加Caspase-3和/或減少Survivin、COX-2蛋白表達(dá)的靶向治療，有望成為阻止皮膚鱗狀細(xì)胞癌形成、發(fā)展的新途徑。

皮膚鱗狀細(xì)胞癌； Survivin； Caspase-3； COX-2

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell careinoma， SCC)是起源于表皮或附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率在皮膚非黑素細(xì)胞癌中僅次于基底細(xì)胞癌，約占全部非黑素細(xì)胞癌的20%[1]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族(inhibitors of apoptosis proteins, IAPs)中作用最強(qiáng)的分子，在多種腫瘤組織中的表達(dá)均增高，而在分化成熟組織中不表達(dá)(胸腺除外)[2]，它的表達(dá)預(yù)示腫瘤有較高的侵襲性和不良預(yù)后[3-4]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡通路中重要的執(zhí)行因子，其表達(dá)異常可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和增殖失調(diào)，從而參與腫瘤等多種疾病的發(fā)生[5]。COX-2是環(huán)氧合酶(cycloxygenase, COX)的亞型，正常情況下絕大部分組織細(xì)胞不表達(dá)COX-2，而在炎癥細(xì)胞因子、有絲分裂原和癌基因等刺激下會(huì)產(chǎn)生[6]。研究表明,COX-2抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，有增加腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的潛能[7]。筆者對確診為SCC的41例患者，采用免疫組化法檢測了Survivin、Caspase-3和COX-2蛋白的表達(dá)，并分析其與臨床病理因素的關(guān)系，探討這3種蛋白在SCC發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 對象與方法

1.1 標(biāo)本來源

標(biāo)本取自2005年1月至2014年1月，遼寧省人民醫(yī)院皮膚科活檢及整形外科手術(shù)切除標(biāo)本的石蠟包埋組織，并由病理科診斷為皮膚鱗狀細(xì)胞癌，共41例。其中男性25例，女性16例；年齡39～78歲，平均60.37歲。另取10例相應(yīng)癌旁正常皮膚組織作為對照。均獲得患者的知情同意。

1.2 主要試劑與方法

1.2.1 主要試劑 Survivin、Caspase-3、COX-2抗體、即用型SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒操作說明書進(jìn)行染色。

1.3 熒光定量PCR(FQ-PCR)

收集新鮮組織置于離心管中，RNA提取及FQ-PCR反應(yīng)體系均嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，數(shù)據(jù)由軟件自動(dòng)提供。Primer Pmmier 5軟件設(shè)計(jì)合成引物見表1。

表1 引物序列

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

免疫組織化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[6]，以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)淡黃至棕黃色細(xì)顆粒狀著色為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)、ANOVA方差分析及Pearson相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 Survivin、Caspase-3和COX-2蛋白的表達(dá)情況

10例癌旁正常皮膚組織均未見蛋白的表達(dá)，SCC組織中陽性表達(dá)率為68.29 %(28/41)，與癌旁正常皮膚組織相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.511，P<0.001)。Caspase-3蛋白在癌旁正常皮膚組織中的陽性表達(dá)率為90%，而在SCC組織中為29.27%，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.863，P=0.002)。COX-2蛋白在癌旁正常皮膚組織中的陽性表達(dá)率為10%，在SCC組織中為73.17%，兩者比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.939，P=0.001 )。見表2；圖1，2。

2.2 Survivin、Caspase-3和COX-2 mRNA在癌旁正常皮膚和SCC組織中的表達(dá)情況

癌旁正常皮膚組織和SCC組織各10例，熒光定量PCR結(jié)果見圖3。以癌旁正常皮膚組織為對照，SCC中Survivin、Caspase-3和COX-2 mRNA的相對表達(dá)量分別是11.21，0.13，9.85，組間比較均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。在癌旁正常皮膚和SCC組織中，Survivin、Caspase-3和COX-2 mRNA表達(dá)趨勢與蛋白表達(dá)趨勢相一致。

2.3 Survivin、Caspase-3和COX-2蛋白在SCC組織中表達(dá)的相關(guān)性分析

在SCC組織中，Survivin與Caspase-3蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(χ2=11.994，P=0.001,R=-0.598)，Survivin與COX-2蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(χ2=14.415，P<0.001,R=0.652)。見表3，4。

3 討論

Survivin蛋白是腫瘤細(xì)胞生存和增殖的重要因子，具有抑制凋亡和參與細(xì)胞周期調(diào)控的作用，并能調(diào)節(jié)細(xì)胞的有絲分裂，參與血管生成，對腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移可能起著重要的作用[8-9]。Survivin蛋白在正常組織中不表達(dá)，而選擇性地表達(dá)于惡性腫瘤組織，這種腫瘤的特異性表達(dá)使其成為近幾年腫瘤診斷和基因治療研究的新靶點(diǎn)。Caspase蛋白酶家族是細(xì)胞凋亡的核心機(jī)制，在細(xì)胞凋亡過程的各個(gè)階段中均發(fā)揮重要作用，并通過級聯(lián)激活而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[10]。Caspase-3基因是Caspase家族中最重要的成員，在很多正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，是細(xì)胞凋亡過程中最重要的效應(yīng)性蛋白裂解酶，大多數(shù)有觸發(fā)細(xì)胞凋亡的因素，最終均需通過Caspase-3介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。Survivin可通過直接或間接作用于Caspase-3，阻斷細(xì)胞的凋亡過程[3,12]，提示Survivin對Caspase-3的表達(dá)可能具有負(fù)反饋機(jī)制。

表2 癌旁正常皮膚、SCC組織中Survivin、Caspase-3和COX-2蛋白的表達(dá)情況

表3 Survivin和Caspase-3蛋白在SCC組織中表達(dá)的相關(guān)性

Tab3 Relation of Survivin and Caspase-3 protein expression in SCC

SurvivinCaspase?3+-合計(jì)χ2PR+3252811．9940．001-0．598-9413合計(jì)122941

表4 Survivin和COX-2蛋白在SCC組織中表達(dá)的相關(guān)性

Tab4 Relation of Survivin and COX-2 protein expression in SCC

圖1 Survivin、Caspase-3和COX-2蛋白在癌旁正常皮膚和SCC組織中的表達(dá) (SP ×100) a.Survivin蛋白呈陰性表達(dá) b. Caspase-3 蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá) c. COX-2 蛋白呈陰性表達(dá)圖2 Survivin、Caspase-3和COX-2蛋白在SCC組織中的表達(dá) (SP ×100) a. Survivin蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá) b. Caspase-3呈弱陽性表達(dá) c. COX-2蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)圖3 FQ-PCR法檢測Survivin、Caspase-3和COX-2 mRNA表達(dá)

Fig1 The expression of Survivin, Caspase-3 and COX-2 protein in para-carcinoma normal skin tissue and SCC by IHC (SP ×100). a. negative expression of Survivin protein. b. strong positive expression o Caspase-3 protein. c. negative expression of COX-2 protein.Fig2 Expression of Survivin, Caspase-3 and COX-2 protein in SCC by IHC (SP ×100). a. strong positive expression of Survivin protein. b. weak positive expression of Caspase-3 protein. c. strong positive expression of COX-2 protein.Fig3 Expression of Survivin, Caspase-3 and COX-2 mRNA in para-carcinoma normal skin and SCC by FQ-PCR.

本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常皮膚組織相比，SCC組織中Survivin表達(dá)升高，而Caspase-3表達(dá)下調(diào)，且兩種蛋白在SCC中的表達(dá)呈顯著的負(fù)相關(guān)。我們推測，SCC發(fā)生和演進(jìn)過程中高表達(dá)的Survivin蛋白通過抑制細(xì)胞凋亡而促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和增生；此外，Survivin也可能通過抑制Caspase-3的活性而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡；Caspase-3蛋白作為介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要中介分子，其低表達(dá)進(jìn)一步抑制了腫瘤細(xì)胞的凋亡。這一結(jié)果提示，Survivin蛋白的高表達(dá)及Caspase-3蛋白的低表達(dá)可能共同參與了SCC的發(fā)病過程。本研究結(jié)果與2004年李海等及2009年邢君等報(bào)道一致[13-14]。

近年來的大量研究表明，COX-2不僅是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵酶，而且在多種人類腫瘤中有不同程度的表達(dá)，包括皮膚腫瘤。COX-2通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制凋亡、促進(jìn)腫瘤新生血管形成等機(jī)制參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，其過度表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，并可作為預(yù)防和治療腫瘤的靶分子[15-16]。在炎癥和腫瘤情況下，COX-2表達(dá)迅速上調(diào)，其產(chǎn)生的大量前列腺E具有免疫抑制效應(yīng)，可抑制T淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞活性，有利于腫瘤細(xì)胞的生存[6]。本研究結(jié)果顯示，SCC組織中COX-2蛋白陽性表達(dá)率為73.17%，顯著高于正常皮膚組織中的表達(dá)，這與2000年Masunaga 等[17]的研究結(jié)果相一致。相關(guān)性分析結(jié)果表明，SCC組織中COX-2蛋白與Survivin表達(dá)呈顯著的正相關(guān)。有研究指出[18]，特異性的COX-2抑制劑能明顯減少Survivin蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)在動(dòng)物模型中還發(fā)現(xiàn)，Survivin蛋白的表達(dá)水平依賴于細(xì)胞中COX-2蛋白的存在，其機(jī)制可能是在COX-2蛋白大量表達(dá)的細(xì)胞中，由于較低水平的蛋白化作用使得Survivin能夠穩(wěn)定地表達(dá)，從而使細(xì)胞的抗凋亡能力大大增強(qiáng)。提示二者在SCC的發(fā)病中具有協(xié)同作用，可能機(jī)制是COX-2通過上調(diào)Survivin來抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞異常增殖，共同參與SCC的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，聯(lián)合檢測Survivin、Caspase-3、COX-2蛋白表達(dá)，對皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有重要意義，而對3種蛋白之間相互作用機(jī)制的進(jìn)一步了解，可能會(huì)給皮膚SCC的診斷和治療帶來新的理論依據(jù)。目前，已有針對Survivin的靶向治療[19]與其他促凋亡治療(如COX-2抑制劑[20]等)結(jié)合，協(xié)同治療腫瘤的多項(xiàng)研究；增加Caspase-3蛋白表達(dá)，和/或抑制Survivin、COX-2在腫瘤組織中的表達(dá)，可能在抗腫瘤治療中具有重要價(jià)值。

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ExpressionofSurvivin,Casepase-3andCOX-2insquamouscellcarcinomaanditsclinicalsignificance

ZHULi-li,XIAOMing-ming,BIAOZhen-shu,etal.
(DepartmentofDermatology,LiaoningProvincialPeople′sHospital,Shenyang110016,China)

ObjectiveTo explore the expression of Survivin, Caspase-3 and COX-2 in para-carcinoma normal skin and squamous cell carcinoma (SCC).MethodsThe expression of Survivin, Caspase-3 and COX-2 in 41 cases of SCC and in 10 cases of para-carcinoma normal skin were detected by fluorescent quatititive PCR (FQ-PCR) and immunological histological chemistry (IHC), respectively.ResultsThe positive rates of Survivin, Caspase-3 and COX-2 in para-carcinoma normal skin were 0, 90.00%, 10.00%, respectively. The positive rates of Survivin, Caspase-3 and COX-2 in SCC were 68.29 %, 29.27%, 73.17%, respectively. Compared with para-carcinoma normal skin, the relative expression of Survivin, Caspase-3 and COX-2 mRNA in SCC were 11.21, 0.13, and 9.85, respectively. The results showed statistically significance. A negative correlation was found between the expression of Survivin and Caspase-3 proteins (χ2=11.994,P=0.001,R=-0.598) in SCC, and there was a highly positive correlation between Survivin and COX-2 protein expression (χ2=14.415,P=0,R=0.652).ConclusionSurvivin, Caspase-3 and COX-2 protein might be involved in the formation of SCC. Survivin and COX-2 proteins may cooperate to promote the progress of SCC. Target treatment of increase the expression of Caspase-3 and/or decrease the expression of Survivin and COX-2 might be possible to prevent the formation of SCC.

Squamous cell careinoma; Survivin; Caspase-3; COX-2

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.05.022

R739.5

A

1673-7040(2014)05-0317-04

2014-03-21)

110016 遼寧 沈陽，遼寧省人民醫(yī)院 皮膚科(祝立麗，表貞淑，劉 洋，李正剛，楊 锎，李銀玲)；遼寧省人民醫(yī)院 病理科(肖明明，高 爽，景士兵)

祝立麗(1983-)，女，浙江金華人，主治醫(yī)師.

景士兵，110016，遼寧省人民醫(yī)院 病理科，電子信箱：mypathology@163.com