張曉南　徐怡　牛延菲

【摘要】目的：測(cè)定食用葛中大豆苷的含量，并進(jìn)行方法學(xué)考察，以期為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供可靠依據(jù)。方法：樣品以甲醇（70%）超聲提取，采用高效液相色譜法測(cè)定，色譜條件為：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱，流動(dòng)相為0～30min，甲醇-水（20∶80→65∶35）線性梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm，柱溫為30℃。 結(jié)果：建立了食用葛中大豆苷含量的測(cè)定方法，進(jìn)行了方法學(xué)考察，并測(cè)定了三個(gè)產(chǎn)的食用葛藥材中的大豆苷含量，其中產(chǎn)于昆明的食用葛含有的大豆苷0.84%，產(chǎn)于大理的含1.12% ，產(chǎn)于香格里拉的含1.87%。結(jié)論：測(cè)定結(jié)果表明各產(chǎn)地間大豆苷含量有明顯差異，本方法能有效測(cè)定食用葛中的大豆苷含量，且較為穩(wěn)定，所得數(shù)據(jù)可為將來(lái)建立食用葛藥材標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】食用葛；大豆苷；含量測(cè)定；高效液相色譜法

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.1【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2014）17-0017-02

The Quantitative Determination of Daidzinn From Ethnomedicine Pueraria edulis Pamp. in Yunnan ZHANG Xiaonan XU Yi NIU Yanfei MAO Hongyun

Yunnan Institute of Materia Medica， Yunnan， Kunming， 650111Abstract：Objective To determine and analyze the content of daidzin from Radix Pueraria edulis Pamp.Methods HPLC method was used to determine and analyze the content of daidzin which were extracted by ultrasonic extraction. Result The results of the samples for the test have shown that the samples from Kunming contain Daidzin 0.84%， the samples from Dali contain 1.12%， the samples from Shangri-La contain 1.87% .Conclusion This method is efficient and stable，can be used in the future quality standards.

Keywords：Pueraria edulis Pamp.； daidzin； quantitative determination； HPLC

食用葛為豆科葛根屬植物食用葛（Pueraria edulis Pamp.）的根，主要分布云南、四川、廣西等地區(qū)，在云南、四川有時(shí)作粉葛藥用，其資源量較為豐富，但現(xiàn)有研究比較薄弱。據(jù)《滇南本草》載“葛根（味甜者甘葛，味苦者苦葛），味甘，性微寒。入陽(yáng)明經(jīng)。治胃虛消渴，傷風(fēng)、傷暑，傷寒，解表邪，發(fā)寒熱往來(lái)，濕瘧，解中酒熱毒。小兒痘疹初出要藥?！盵1] 。食用葛根中含有尿囊素，二十四酸-α-甘油酯，β-谷甾醇，大豆苷元，染料木苷，大豆苷，葛根素，大豆苷元-8-C-芹菜糖（1→6）葡萄糖苷等成分。[2] 在其有效成分中，最受關(guān)注的是異黃酮類(lèi)，也是其主要活性成分，本文選取其含量較高的異黃酮類(lèi)成分大豆苷，建立其含量測(cè)定方法，以期為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供可靠依據(jù)。

1藥材、儀器、藥品與試劑

1.1食用葛藥材采自香格里拉、昆明、大理，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所分類(lèi)鑒定室陶德定副研究員鑒定為食用葛Pueraria edulis Pamp.。

1.2Agilent1100型高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器，Agilent Chemstation 工作站。

1.3大豆苷對(duì)照品：中國(guó)食品藥品檢測(cè)研究院提供，批號(hào)：111738-201302。

試藥：甲醇（色譜純），水（超純水），95%乙醇（分析純）。

2方法與結(jié)果

2.1液相色譜條件結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[3～6]和實(shí)驗(yàn)研究，色譜條件確定為：色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18；流動(dòng)相：甲醇-水，線性梯度洗脫，條件見(jiàn)下表；流速：1ml/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm；進(jìn)樣量：10μl。

表1梯度洗脫條件

時(shí)間/min甲醇/%水/%02080305634322080

2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備精密稱(chēng)取大豆苷對(duì)照品20mg，加70%甲醇溶解，定容到25ml，即為標(biāo)準(zhǔn)品母液，取母液適量，加70%甲醇稀釋到需要濃度即得。

2.3供試品溶液制備精密稱(chēng)取食用葛藥材約0.2g，加入甲醇（70%）20ml，稱(chēng)定重量，超聲提取30min（59KHz， 325W），放冷，用甲醇（70%）補(bǔ)足失重，濾過(guò)，濾液用0.2μm濾膜濾過(guò)，即得。

2.4線性關(guān)系考察精密量取大豆苷標(biāo)準(zhǔn)品母液適量，70%甲醇稀釋?zhuān)謩e配制成濃度為3.0、10.0、20.0、50.0、80.0、100.0、200.0ug/ml的對(duì)照品溶液，照確定的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，由濃度及相應(yīng)峰面積得線性方程和相關(guān)系數(shù)。

表2線性關(guān)系考察（n=7）

濃度ug/ml3.010.020.050.080.0100.0200.0峰面積79.4314.5662.41684.32738.93497.97060.8

線性方程：Y=35.473X—55.138，r2=0.9999，大豆苷在3～200ug/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。endprint

2.5精密度考察取同一大豆苷標(biāo)準(zhǔn)液（20ug/ml），按選定色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積RSD為0.55 %<3%，表明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性精密稱(chēng)取食用葛藥材（產(chǎn)地昆明）6份，按照2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，測(cè)定大豆苷量，測(cè)得大豆苷平均含量為1692.9ug/g，RSD為2.17%，表明本方法重復(fù)性良好

2.7回收率試驗(yàn)稱(chēng)取已知含量的食用葛藥材（1692.9ug/g）9份，以1∶0.5，1∶1，1∶1.5分別精密加入大豆苷對(duì)照品，按照供試品溶液制備方法制備，測(cè)定大豆苷量，計(jì)算回收率，回收率為98.4%～103.2%，RSD為1.49%<3%。結(jié)果見(jiàn)下表3：

2.8耐用性試驗(yàn)

2.8.1不同色譜柱考察選用不同品牌的三根色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm）， Waters Symmetry C18（4.6×250mm，5μm），Shiseido C18（4.6×250mm，5μm）；對(duì)供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液用2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果表明三根色譜柱保留時(shí)間與峰形略有差異，但大豆苷的峰都能完全分離，分離度達(dá)到1.5以上，且所測(cè)得的大豆苷含量只是略有差異。

2.8.2不同柱溫考察改變柱溫，其他條件不變，用2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定供試品溶液（產(chǎn)地昆明），記錄色譜圖，結(jié)果表明柱溫在有變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受大的影響，20℃時(shí)出峰時(shí)間為17.321min，峰面積為625.16；30℃是出峰時(shí)間為14.087min，峰面積為627.15；40℃時(shí)，出峰時(shí)間為14.523min，峰面積為634.62。

2.8.3不同儀器考察選用不同品牌的三臺(tái)高效液相色譜儀：Agilent 1100， Waters 2695，Shimadzu LC 2010；用2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果表明在儀器的品牌、型號(hào)有變動(dòng)時(shí)，大豆苷的峰能夠完全分離，且進(jìn)樣濃度有小的波動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受大的影響，在儀器穩(wěn)定的情況下，仍可以準(zhǔn)確進(jìn)行定量測(cè)定。

2.9供試品溶液穩(wěn)定性考察取同一供試品溶液（產(chǎn)地昆明），分別在0h、2h、6h、12h照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果大豆苷含量RSD值為1.75%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10樣品測(cè)定取不同產(chǎn)地的樣品，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄各成分的峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中各成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。三個(gè)產(chǎn)地食用葛藥材中大豆苷含量分別為1.87%（香格里拉），1.12%（大理），0.84%（昆明）。

3討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，云南三個(gè)產(chǎn)地的食用葛中都含有一定量的大豆苷，但含量有明顯差異，產(chǎn)于大理和香格里拉的含量都高于昆明，這從一個(gè)方面提示食用葛將來(lái)栽培的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)可在滇西北遴選。

在筆者的研究中還發(fā)現(xiàn)，食用葛不含葛根素，與藥典規(guī)定的粉葛在成分上差異較大，是否能與粉葛混用值得考證。如果食用葛作為地方習(xí)用藥藥用，則需新制定專(zhuān)門(mén)的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本項(xiàng)研究的成果可為此提供可靠數(shù)據(jù)。此外，我們還進(jìn)行過(guò)食用葛水提物解酒作用和急性毒性方面的研究，結(jié)果表明食用葛水提物有較明顯的解酒作用，且毒性較低，在將來(lái)的保健品開(kāi)發(fā)中是值得注意的優(yōu)質(zhì)資源。

參考文獻(xiàn)

[1]滇南本草整理組.《滇南本草》（整理本.第2卷）[M].昆明：云南人民出版社，1977：212.

[2]史海明，閔知大.食用葛根的化學(xué)成分研究[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，31（6）：411.

[3]欒玉泉，何作順.大理食用葛根中葛根素和葛根總黃酮含量分析與評(píng)價(jià)[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，32（3）：20-21.

[4]阮建林，張?chǎng)?，谷俊峰，?云南產(chǎn)葛根的葛根素及總黃酮含量測(cè)定[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2000，21（3）：39-40.

[5]裴香萍，劉亞明.野葛、粉葛與云南葛中葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的含量比較[J].中國(guó)藥房，2012，23（47）：4462-4464

[6]胡江琴，王利琳.葛根的化學(xué)成分分析[J].杭州師范學(xué)報(bào)，1993（3）：70-73.endprint

2.5精密度考察取同一大豆苷標(biāo)準(zhǔn)液（20ug/ml），按選定色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積RSD為0.55 %<3%，表明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性精密稱(chēng)取食用葛藥材（產(chǎn)地昆明）6份，按照2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，測(cè)定大豆苷量，測(cè)得大豆苷平均含量為1692.9ug/g，RSD為2.17%，表明本方法重復(fù)性良好

2.7回收率試驗(yàn)稱(chēng)取已知含量的食用葛藥材（1692.9ug/g）9份，以1∶0.5，1∶1，1∶1.5分別精密加入大豆苷對(duì)照品，按照供試品溶液制備方法制備，測(cè)定大豆苷量，計(jì)算回收率，回收率為98.4%～103.2%，RSD為1.49%<3%。結(jié)果見(jiàn)下表3：

2.8耐用性試驗(yàn)

2.8.1不同色譜柱考察選用不同品牌的三根色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm）， Waters Symmetry C18（4.6×250mm，5μm），Shiseido C18（4.6×250mm，5μm）；對(duì)供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液用2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果表明三根色譜柱保留時(shí)間與峰形略有差異，但大豆苷的峰都能完全分離，分離度達(dá)到1.5以上，且所測(cè)得的大豆苷含量只是略有差異。

2.8.2不同柱溫考察改變柱溫，其他條件不變，用2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定供試品溶液（產(chǎn)地昆明），記錄色譜圖，結(jié)果表明柱溫在有變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受大的影響，20℃時(shí)出峰時(shí)間為17.321min，峰面積為625.16；30℃是出峰時(shí)間為14.087min，峰面積為627.15；40℃時(shí)，出峰時(shí)間為14.523min，峰面積為634.62。

2.8.3不同儀器考察選用不同品牌的三臺(tái)高效液相色譜儀：Agilent 1100， Waters 2695，Shimadzu LC 2010；用2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果表明在儀器的品牌、型號(hào)有變動(dòng)時(shí)，大豆苷的峰能夠完全分離，且進(jìn)樣濃度有小的波動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受大的影響，在儀器穩(wěn)定的情況下，仍可以準(zhǔn)確進(jìn)行定量測(cè)定。

2.9供試品溶液穩(wěn)定性考察取同一供試品溶液（產(chǎn)地昆明），分別在0h、2h、6h、12h照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果大豆苷含量RSD值為1.75%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10樣品測(cè)定取不同產(chǎn)地的樣品，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄各成分的峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中各成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。三個(gè)產(chǎn)地食用葛藥材中大豆苷含量分別為1.87%（香格里拉），1.12%（大理），0.84%（昆明）。

3討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，云南三個(gè)產(chǎn)地的食用葛中都含有一定量的大豆苷，但含量有明顯差異，產(chǎn)于大理和香格里拉的含量都高于昆明，這從一個(gè)方面提示食用葛將來(lái)栽培的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)可在滇西北遴選。

在筆者的研究中還發(fā)現(xiàn)，食用葛不含葛根素，與藥典規(guī)定的粉葛在成分上差異較大，是否能與粉葛混用值得考證。如果食用葛作為地方習(xí)用藥藥用，則需新制定專(zhuān)門(mén)的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本項(xiàng)研究的成果可為此提供可靠數(shù)據(jù)。此外，我們還進(jìn)行過(guò)食用葛水提物解酒作用和急性毒性方面的研究，結(jié)果表明食用葛水提物有較明顯的解酒作用，且毒性較低，在將來(lái)的保健品開(kāi)發(fā)中是值得注意的優(yōu)質(zhì)資源。

參考文獻(xiàn)

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[2]史海明，閔知大.食用葛根的化學(xué)成分研究[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，31（6）：411.

[3]欒玉泉，何作順.大理食用葛根中葛根素和葛根總黃酮含量分析與評(píng)價(jià)[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，32（3）：20-21.

[4]阮建林，張?chǎng)?，谷俊峰，?云南產(chǎn)葛根的葛根素及總黃酮含量測(cè)定[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2000，21（3）：39-40.

[5]裴香萍，劉亞明.野葛、粉葛與云南葛中葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的含量比較[J].中國(guó)藥房，2012，23（47）：4462-4464

[6]胡江琴，王利琳.葛根的化學(xué)成分分析[J].杭州師范學(xué)報(bào)，1993（3）：70-73.endprint

2.5精密度考察取同一大豆苷標(biāo)準(zhǔn)液（20ug/ml），按選定色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積RSD為0.55 %<3%，表明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性精密稱(chēng)取食用葛藥材（產(chǎn)地昆明）6份，按照2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，測(cè)定大豆苷量，測(cè)得大豆苷平均含量為1692.9ug/g，RSD為2.17%，表明本方法重復(fù)性良好

2.7回收率試驗(yàn)稱(chēng)取已知含量的食用葛藥材（1692.9ug/g）9份，以1∶0.5，1∶1，1∶1.5分別精密加入大豆苷對(duì)照品，按照供試品溶液制備方法制備，測(cè)定大豆苷量，計(jì)算回收率，回收率為98.4%～103.2%，RSD為1.49%<3%。結(jié)果見(jiàn)下表3：

2.8耐用性試驗(yàn)

2.8.1不同色譜柱考察選用不同品牌的三根色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm）， Waters Symmetry C18（4.6×250mm，5μm），Shiseido C18（4.6×250mm，5μm）；對(duì)供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液用2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果表明三根色譜柱保留時(shí)間與峰形略有差異，但大豆苷的峰都能完全分離，分離度達(dá)到1.5以上，且所測(cè)得的大豆苷含量只是略有差異。

2.8.2不同柱溫考察改變柱溫，其他條件不變，用2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定供試品溶液（產(chǎn)地昆明），記錄色譜圖，結(jié)果表明柱溫在有變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受大的影響，20℃時(shí)出峰時(shí)間為17.321min，峰面積為625.16；30℃是出峰時(shí)間為14.087min，峰面積為627.15；40℃時(shí)，出峰時(shí)間為14.523min，峰面積為634.62。

2.8.3不同儀器考察選用不同品牌的三臺(tái)高效液相色譜儀：Agilent 1100， Waters 2695，Shimadzu LC 2010；用2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果表明在儀器的品牌、型號(hào)有變動(dòng)時(shí)，大豆苷的峰能夠完全分離，且進(jìn)樣濃度有小的波動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受大的影響，在儀器穩(wěn)定的情況下，仍可以準(zhǔn)確進(jìn)行定量測(cè)定。

2.9供試品溶液穩(wěn)定性考察取同一供試品溶液（產(chǎn)地昆明），分別在0h、2h、6h、12h照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果大豆苷含量RSD值為1.75%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10樣品測(cè)定取不同產(chǎn)地的樣品，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄各成分的峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中各成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。三個(gè)產(chǎn)地食用葛藥材中大豆苷含量分別為1.87%（香格里拉），1.12%（大理），0.84%（昆明）。

3討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，云南三個(gè)產(chǎn)地的食用葛中都含有一定量的大豆苷，但含量有明顯差異，產(chǎn)于大理和香格里拉的含量都高于昆明，這從一個(gè)方面提示食用葛將來(lái)栽培的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)可在滇西北遴選。

在筆者的研究中還發(fā)現(xiàn)，食用葛不含葛根素，與藥典規(guī)定的粉葛在成分上差異較大，是否能與粉葛混用值得考證。如果食用葛作為地方習(xí)用藥藥用，則需新制定專(zhuān)門(mén)的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本項(xiàng)研究的成果可為此提供可靠數(shù)據(jù)。此外，我們還進(jìn)行過(guò)食用葛水提物解酒作用和急性毒性方面的研究，結(jié)果表明食用葛水提物有較明顯的解酒作用，且毒性較低，在將來(lái)的保健品開(kāi)發(fā)中是值得注意的優(yōu)質(zhì)資源。

參考文獻(xiàn)

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[2]史海明，閔知大.食用葛根的化學(xué)成分研究[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，31（6）：411.

[3]欒玉泉，何作順.大理食用葛根中葛根素和葛根總黃酮含量分析與評(píng)價(jià)[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，32（3）：20-21.

[4]阮建林，張?chǎng)崳瓤》?，?云南產(chǎn)葛根的葛根素及總黃酮含量測(cè)定[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2000，21（3）：39-40.

[5]裴香萍，劉亞明.野葛、粉葛與云南葛中葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的含量比較[J].中國(guó)藥房，2012，23（47）：4462-4464

[6]胡江琴，王利琳.葛根的化學(xué)成分分析[J].杭州師范學(xué)報(bào)，1993（3）：70-73.endprint