陸 露，鄭麗屏，趙培飛，王劍文

(1.蘇州大學 醫(yī)學部 藥學院，蘇州 215123;2.蘇州大學 金螳螂建筑與城市環(huán)境學院，蘇州 215123;3.云南省農(nóng)業(yè)科學院 園藝作物研究所，昆明 650205)

金屬-無機納米核殼復合材料因同時具有納米粒徑和復合組分，被廣泛應用于傳感器、催化、信息存儲、抗體檢測、涂料、農(nóng)業(yè)及植物研究等領域［1-3］。通過制備Ag-SiO2核-殼型納米粒，可以在提高核心農(nóng)藥物質(zhì)穩(wěn)定性的同時，發(fā)揮緩釋核心物質(zhì)的效果［4］。Ag-SiO2核殼型納米粒以 SiO2殼層包裹 Ag+，可有效屏蔽內(nèi)核Ag+的相互作用，得到單分散的核殼顆粒，其外層SiO2具有良好的生物相容性和多孔結(jié)構(gòu)，保持了Ag+的化學活性和催化活性。同時，細菌對 Ag+不易產(chǎn)生耐藥性［5］，是一種長效抗菌劑［6］。Kim 等［7］于2007 年發(fā)現(xiàn) Ag-SiO2核殼型納米粒具有較好的抑制細菌生長作用。Zheng等［8］的研究表明:Ag-SiO2核殼型納米粒對6種植物病原真菌具有強烈的抑制作用，但有關Ag-SiO2核殼型納米粒抗病原真菌的過程和機制研究則少見報道。

香石竹枯萎病是由鐮刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.dianthi，race 2)侵染所致的土傳病害，是對香石竹最嚴重的病害之一，在世界各香石竹種植區(qū)均有發(fā)生［9］。此病在我國各香石竹種植區(qū)亦有普遍發(fā)生，危害較重，昆明地區(qū)一般發(fā)病率為10% ～30%，重者達70% ～80%［10］，因此，亟須應用新的防治方法。筆者在前期研究的基礎上，采用改進的St?ber法制備 Ag-SiO2復合納米顆粒［11］，并對復合納米顆粒結(jié)構(gòu)進行了表征，研究Ag-SiO2納米懸浮液對鐮刀菌菌絲、孢子生長的抑制及對真菌抗氧化酶的影響，初步探討了Ag-SiO2核殼型納米粒的抑菌機制，以期為Ag-SiO2核殼型納米粒的抗菌應用，以及為香石竹枯萎病的防治提供納米抗菌技術的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

香石竹鐮刀菌2號生理小種(Fusarium oxysporum f.sp.dianthi，race 2)由云南省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所提供。

1.2 試驗材料及培養(yǎng)基

真菌培養(yǎng)均采用馬鈴薯固體培養(yǎng)基(簡稱PDA)和馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(簡稱 PD)。AgNO3、溴化十六烷基三甲銨(CTAB)、氨水、乙醇與正硅酸四乙酯等均為國產(chǎn)分析純。

1.3 Ag-SiO2納米粒的制備

Ag-SiO2納米粒的制備參考文獻［11］的方法，略作修改。將0.145 g CTAB溶于180 mL去離子水，加熱并磁力攪拌使其充分溶解，加入0.1 mol/L的AgNO3溶液10 mL，于5 min內(nèi)加入5 mmol/L抗壞血酸溶液10 mL，繼續(xù)攪拌30 min，加入30%(體積分數(shù))氨水至pH約為6。加入50 mL無水乙醇與1 mL正硅酸四乙酯，室溫繼續(xù)攪拌4 h。將產(chǎn)物經(jīng)中速定性濾紙過濾，去離子水與無水乙醇洗滌，經(jīng)121℃、25 min高壓蒸氣滅菌后，置于烘箱100℃烘干。

1.4 納米粒的分析與表征

采用日本Shimadzu公司UV2401-PC紫外-可見分光光度計在波長300～500 nm范圍內(nèi)掃描，通過觀察銀的特征吸收峰變化來判斷反應過程中的具體變化。采用荷蘭 Philips-FEI公司 XL30 ESEMTMP環(huán)境掃描電鏡觀察Ag-SiO2納米粒的形貌、尺寸及分散情況;采用美國PSS公司的380ZLS型粒徑和電位分析儀測定粒徑大小。

1.5 抑菌作用的測定

采用杯碟法測定Ag-SiO2納米粒對鐮刀菌的抑制作用［12］。將Ag-SiO2納米粒用PD液體培養(yǎng)基分別稀釋成 0、2、4、8、16、32、64 和 128 μg/mL，備用。取15 mL滅菌后的PDA培養(yǎng)基置于直徑9 cm培養(yǎng)皿中，作為下層培養(yǎng)基，再將10 mL含有105個/mL鐮刀菌的PDA培養(yǎng)基均勻覆蓋在冷卻后的下層PDA培養(yǎng)基上，靜置冷卻1 h。而后在每塊平板上放置4個牛津杯(直徑0.6 cm，高1.0 cm)，分別向每個牛津杯內(nèi)加入100 μL不同濃度Ag-SiO2納米粒懸浮液，水平放置直到液體完全滲透到培養(yǎng)基中。將處理后的平板置于(28±1)℃培養(yǎng)箱中，以PD液體培養(yǎng)基為對照，培養(yǎng)3 d后觀察抑菌效果。

1.6 菌絲和孢子生長的顯微觀察

取15 mL滅菌后的PDA培養(yǎng)基置于9 cm培養(yǎng)皿中，作為下層培養(yǎng)基。將10 mL含有105個/mL鐮刀菌的PDA培養(yǎng)基均勻覆蓋在冷卻后的下層PDA培養(yǎng)基上，靜置冷卻1 h。而后在每塊平板上放置4個牛津杯，分別加入100 μL用PD液體培養(yǎng)基稀釋的Ag-SiO2納米粒(32 μg/mL)和 PD 液體培養(yǎng)基，水平放置直到液體完全滲透到培養(yǎng)基中。將處理后的平板置于(28±1)℃培養(yǎng)箱中，每個處理3次重復。培養(yǎng)3 d后，在體視顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)，研究Ag-SiO2納米粒對鐮刀菌菌絲生長的影響。

采用凹玻片水滴法觀察Ag-SiO2納米粒對鐮刀菌孢子生長的影響，吸取100 μL孢子懸浮液以及100 μL納米銀溶液混勻后，滴在載玻片上，加蓋蓋玻片，置于帶濕海綿的培養(yǎng)皿內(nèi)，將培養(yǎng)皿放入(28±1)℃培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)，分別于48、96 h后在倒置顯微鏡下鏡檢孢子的生長發(fā)育情況。

1.7 菌體蛋白含量及抗氧化相關酶活性的測定

在PDA平板中接種鐮刀菌，培養(yǎng)3 d后，用打孔器打取直徑4 mm的菌碟，轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)5 d后，取出長好的鐮刀菌菌絲體，用蒸餾水沖洗3次后用吸水紙吸干，準確稱取質(zhì)量0.25 g菌絲，分別放入100 mL納米銀(32 μg/mL)溶液和蒸餾水對照溶液中浸泡2、4、10和20 h，菌絲體過濾取出后用蒸餾水沖洗3次后用吸水紙吸干，加入0.86%生理鹽水3 mL在冰浴下研磨，3000 r/min離心15 min，取上清液，置于4℃冰箱保存，待用。待測液蛋白質(zhì)含量通過 Bradford法［13］測定。蛋白質(zhì)含量標準曲線利用不同濃度牛血清白蛋白標準溶液繪制。超氧化物歧化酶活力采用NBT法測定［14］。過氧化氫酶酶活力測定參照文獻［15］的方法，過氧化物酶活力測定參照文獻［16］的方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ag-SiO2納米粒的制備及表征分析

對Ag-SiO2納米粒形成過程進行了紫外光譜分析，如圖1(a)所示。由圖1(a)可知，隨著抗壞血酸的加入，410 nm附近逐漸出現(xiàn)吸收峰，為單質(zhì)Ag+的特征吸收峰［17］。說明隨著反應的進行有Ag+被還原出來。而隨后檢測發(fā)現(xiàn)，在410 nm附近Ag+特征吸收峰存在一定的紅移，從408 nm處到414 nm，提示Ag+納米粒逐漸被SiO2外殼所包覆，這與參考文獻［11］報道一致。而環(huán)境掃描電鏡顯示(圖1(b))納米粒為近似球形，粒徑約為100 nm。為進一步確定Ag-SiO2納米粒的平均粒徑，試樣經(jīng)乙醇分散，去離子水稀釋后通過激光粒度儀測定(圖1(c))，3次重復實驗結(jié)果顯示所制備納米粒平均粒徑為92.9 nm。

圖1 Ag-SiO2納米粒的表征Fig.1 Characterization of Ag-SiO2nanoparticles

2.2 對鐮刀菌的生長抑制作用

圖2為Ag-SiO2納米溶液對鐮刀菌的生長抑制實驗結(jié)果。由圖2可知，在抑菌圈試驗中，Ag-SiO2納米溶液對鐮刀菌表現(xiàn)出良好的抑制作用，最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)為4 μg/mL，且抑制效果隨濃度增大而增強，在32 μg/mL條件下，其抑制效果最好。在后續(xù)實驗中以此濃度進一步實驗。

圖3為Ag-SiO2納米粒對香石竹鐮刀菌菌絲生長形態(tài)的影響結(jié)果。由圖3可知:在32 μg/mL Ag-SiO2納米粒作用下，鐮刀菌菌絲體的生長呈現(xiàn)異常狀態(tài)，菌絲較細、分支減少、欲折、透明度差，而對照菌絲生長正常、粗細均勻、分支較多、透明度較大。由此可知，Ag-SiO2納米?？赡軙偈圭牭毒儯蛊錈o法正常生長，失去侵染植物能力。

圖2 Ag-SiO2納米粒對香石竹鐮刀菌的生長抑制影響Fig.2 Effects of the Ag-SiO2nanoparticles on growth inhibition of Fusarium oxysporum f.sp.dianthi

圖3 Ag-SiO2納米粒對香石竹鐮刀菌菌絲生長形態(tài)的影響Fig.3 Effects of Ag-SiO2nanoparticles on mycelia growth of Fusarium oxysporum f.sp.Dianthi

以不同濃度Ag-SiO2納米粒處理鐮刀菌孢子，在24、72 h對孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)進行了觀察，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知:在對照條件下，一個產(chǎn)孢細胞上可相繼形成多個產(chǎn)孢位點，每個產(chǎn)孢位點以吹泡式產(chǎn)生全壁芽殖式分生孢子。且隨著納米銀濃度的加大，產(chǎn)孢位點逐漸減少，并不能正常分生出小孢子。后續(xù)實驗觀察到，在高濃度納米銀處理組(128 μg/mL)作用下，菌絲已經(jīng)無法分生出孢子。

圖4 Ag-SiO2納米粒濃度對香石竹鐮刀菌孢子形態(tài)的影響Fig.4 Effects of Ag-SiO2nanoparticles concertration on spore morphology of Fusarium oxysporum f.sp.Dianthi

2.3 Ag-SiO2納米粒對鐮刀菌體蛋白含量的影響

考察Ag-SiO2納米粒對鐮刀菌體蛋白含量的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知:經(jīng)32 μg/mL Ag-SiO2納米粒處理后，發(fā)現(xiàn)鐮刀菌菌體的可溶性蛋白含量變化范圍較小，處理4 h后，菌體中可溶性蛋白含量比對照升高了8.50%，而處理20 h則比對照降低了1.47%。這與孫冬梅等［18］報道的納米銀對大豆菌核病核盤菌的抑制中可溶性蛋白變化相一致，而一些研究者也發(fā)現(xiàn)某些抑菌劑能抑制菌體蛋白質(zhì)的合成［19］，推測Ag-SiO2納米粒對菌體的抑制并非通過抑制蛋白質(zhì)的合成而起作用。

圖5 Ag-SiO2納米粒對鐮刀菌體蛋白的影響Fig.5 Effects of Ag-SiO2nanoparticles on mycelium protein content of Fusarium oxysporum f.sp.dianthi

2.4 Ag-SiO2納米粒對鐮刀菌抗氧化酶活性的影響

圖6為Ag-SiO2納米粒對鐮刀菌抗氧化酶活性的影響結(jié)果。由圖6可知:經(jīng)Ag-SiO2納米粒處理后，鐮刀菌菌體的總超氧化物歧化酶(SOD)活性增加，處理4 h后比對照組活性升高了28.14%，說明過氧化氫酶(CAT)在活性氧代謝中發(fā)揮重要的作用，是清除H2O2的主要酶類。菌絲處理2、4 h后，菌體過氧化氫酶活性分別比對照升高了48.18%、37.09%，而處理10、20 h比對照降低了15.00%、46.93%。Ag-SiO2納米粒處理后鐮刀菌菌體過氧化物酶(POD)活性變化較大，處理2、4、10 h分別比對照升高170.42%、98.68%、36.69%。處理20 h比對照降低了47.16%。

3 結(jié)論

本文以AgNO3作為Ag+來源，利用抗壞血酸對其進行還原生成銀納米粒核心;利用正硅酸四乙酯的水解與聚合反應獲得SiO2，使其包裹在銀核心外形成介孔外殼，最終制備Ag-SiO2核殼型納米粒，平均粒徑約為92.9 nm，發(fā)現(xiàn)可以有效地抑制香石竹鐮刀菌的生長，且最小抑菌質(zhì)量濃度為4 μg/mL。

圖6 Ag-SiO2納米粒對鐮刀菌總SOD、CAT和POD活性的影響Fig.6 Effects of Ag-SiO2nanoparticles on SOD(a)，CAT(b)and POD(c)activity of Fusarium oxysporum f.sp.dianthi mycelium

進一步實驗結(jié)果表明:Ag-SiO2核殼型納米粒可能通過真菌中活性氧的誘導產(chǎn)生，導致菌絲生長畸形、孢子分生困難，從而抑制真菌的生長。隨著納米銀材料在醫(yī)藥領域上的廣泛應用，納米銀的制備，抗菌和抗腫瘤機制被越來越深入地探討，但在農(nóng)業(yè)上的應用還少見報道，本研究為其在植物病原真菌防治上的應用提供了Ag-SiO2核殼型納米粒合成的方法，該方法簡單有效且低成本。由此可見深入了解納米銀的抗菌機制，對于實現(xiàn)及農(nóng)業(yè)應用也非常重要。

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