胡集鋮，王 歡，李 亞，韓萍芳

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，南京 211800)

脂肪酶因其催化反應(yīng)的高效性［1-2］、高立體選擇性［3］、反應(yīng)條件溫和等特點備受關(guān)注。然而，游離酶穩(wěn)定性差、反應(yīng)后難以與產(chǎn)品分離、不易重復(fù)利用，這些缺點制約了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。為了提高其穩(wěn)定性和利用效率，酶的固定化逐漸成為酶工程研究領(lǐng)域的熱點。固定化酶的性能主要取決于固定化方法和所使用的載體材料。目前，制備固定化酶的方法主要有吸附法、共價法、交聯(lián)法、包埋法等，其中吸附法因操作簡便、條件溫和，不會引起酶失活被廣泛使用。理想的載體則應(yīng)具備良好的機械強度、熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性等特點，如二氧化硅［4-6］、多糖類［7-9］、高分子納米纖維［10-13］、納米粒子［14-15］等材料已被成功地用于固定化酶。

作為一類純天然的礦物材料，硅酸鹽黏土因具有價格低廉、比表面積大、孔隙率高、良好的吸附性和生物親和性等優(yōu)點被廣泛用于吸附固定化酶。但是，凹土等傳統(tǒng)載體固定化酶仍然存在從反應(yīng)體系中分離較為復(fù)雜的缺點。對傳統(tǒng)載體進(jìn)行功能化修飾是目前克服該缺點的理想方案之一，如磁性復(fù)合載體的制備與應(yīng)用。一方面，在外加磁場作用下，可以使固定化酶簡單地從反應(yīng)體系分離;另一方面，外部磁場使固定化酶的運動方式和方向得到控制，替代傳統(tǒng)的機械攪拌，可以提高固定化酶的催化效率。

筆者通過制備γ-Fe2O3-凹土超順磁性納米復(fù)合材料(γ-Fe2O3-ATP)，并將其用于豬胰脂肪酶的固定化，考察酶固定化條件及固定化酶的性質(zhì)，以期為其在工業(yè)化方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

豬胰脂肪酶(PPL，BR)，南京奧多福尼生物技術(shù)有限責(zé)任公司;凹凸棒石黏土(以下簡稱“凹土”)，江蘇澳特邦非金屬礦業(yè)有限公司;NaHCO3、NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH(均為AR)，廣東汕頭西隴化工廠;FeCl3·6H2O(AR)、聚乙烯醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;橄欖油(化學(xué)純)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;冰醋酸(AR)，上海申博化工有限公司。

1.2 實驗儀器

DSHZ-300A型恒溫振蕩器，太倉市試驗設(shè)備廠;GL-21M型離心機，上海離心機械研究所;752紫外-可見光分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司;開啟管式電阻爐，山東省龍口市先科儀器公司;H-800透射電子顯微鏡，日本日立公司;ASAP2010全自動比表面積及孔徑分布測定儀，美國Micromeritics公司;振動試樣磁強計，Lakeshore Cryotronic公司。

1.3 γ-Fe2O3-ATP的制備與表征

γ-Fe2O3-ATP的制備方法參照文獻(xiàn)［16］的方法:配制0.02 mol/L FeCl3·6H2O溶液，調(diào)節(jié) pH至2.5并室溫攪拌1 h，再將其緩慢逐滴加到凹土懸浮液中并不斷攪拌，離心得到 Fe3+-ATP，水洗至無Cl-，室溫真空干燥后，研磨成粉末。將試樣粉末暴露于80℃ 冰醋酸蒸氣中，熏蒸3 h后暴露于相同溫度的空氣中幾分鐘，去除表面吸附的冰醋酸，得到FeAc3-ATP。在N2保護(hù)下400℃煅燒1 h后，即得到磁性試樣γ-Fe2O3-ATP。

透射電子顯微鏡(TEM)表征:將制備好的γ-Fe2O3-ATP用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察，研究其表面形貌特征。

比表面積和孔徑分布測定:通過ASAP2010全自動比表面積及孔徑分布測定儀測定γ-Fe2O3-ATP的比表面積和平均孔徑。

磁性能測定:將γ-Fe2O3-ATP在室溫下通過振動試樣磁強計測定其飽和磁化強度。

1.4 脂肪酶的固定化

向100 mL具塞三角燒瓶中加入2 mg/mL酶液40 mL、γ-Fe2O3-ATP 80 mg，在 25 ℃、110 r/min恒溫水浴振蕩器中固定一定時間以后，取出三角燒瓶，利用外加磁場使上清液和固定化酶分離。上清液中蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)測定，其減少的蛋白質(zhì)量即為γ-Fe2O3-ATP上所固載的脂肪酶含量。

固載上的酶蛋白量與載體量的比例可以由式Pa=(ρi-ρf)V/m 計算得出。

式中:Pa為每克載體上固載的酶蛋白的量，mg/g;ρi和ρf分別為反應(yīng)前和反應(yīng)后酶溶液的質(zhì)量濃度，mg/mL;V為反應(yīng)液體積，mL;m為使用的載體的質(zhì)量，g。

1.5 脂肪酶活力的測定

脂肪酶活力的測定以橄欖油為底物，采用直接酸堿滴定法［17-18］。一個酶活力單位(U)定義為在溫度為37℃的條件下，1 h從橄欖油中水解產(chǎn)生1 μmol脂肪酸所需的酶量。

2 結(jié)果與討論

2.1 γ-Fe2O3-ATP的表征

2.1.1 透射電子顯微鏡(TEM)表征

圖1為制備好的γ-Fe2O3-ATP用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察的結(jié)果。由圖1可知:凹土呈棒狀，γ-Fe2O3呈黑色球狀，平均粒徑為 10 nm，γ-Fe2O3粒子分布在凹土外表面上。這種分布原因可能是凹土表面存在一些負(fù)電荷和一些暴露出來的可交換的Al3+、Mg2+等陽離子，F(xiàn)e3+通過靜電作用和凹土的離子交換性質(zhì)結(jié)合在凹土表面，經(jīng)過醋酸熏蒸形成醋酸鐵，煅燒后與凹土形成穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)覆蓋在其表面。

圖1 γ-Fe2O3-ATP透射電鏡照片F(xiàn)ig.1 TEM images of superparamagnetic γ-Fe2O3-attapulgite nanocomposites

2.1.2 N2等溫吸附-脫附(BET)表征

γ-Fe2O3-ATP等溫吸附-脫附曲線為 Langmuir IV型曲線(圖2)。由圖2可知:在相對壓力達(dá)到0.5左右時，吸附等溫線和脫附等溫線開始不重合，出現(xiàn)了H3型的滯后環(huán)，說明載體中存在介孔。經(jīng)測定γ-Fe2O3-ATP的平均孔徑為10.862 nm與豬胰脂肪酶尺寸相似，使得脂肪酶很容易進(jìn)入其孔道中。γ-Fe2O3-ATP有較高的比表面積為102.63 m2/g ，較 Zhao等［19］化學(xué)法合成的48.5 m2/g高，使得固載率提高。

圖2 γ-Fe2O3-ATP吸附-脫附等溫曲線Fig.2 N2adsorption-desorption isotherms of superparamagnetic γ-Fe2O3-attapulgite nanocomposites

2.1.3 振動試樣磁強計(VSM)表征

圖3為γ-Fe2O3-ATP在室溫下表現(xiàn)出超順磁性特征結(jié)果。由圖3可知:當(dāng)外界有磁場時載體能夠迅速被磁化且有較強磁性，當(dāng)外界磁場消失時載體的磁性能夠迅速隨之消失。這種性質(zhì)有利于載體從反應(yīng)介質(zhì)中分離，載體不會因磁化而團(tuán)聚，有利于載體的重新分散。經(jīng)測定，γ-Fe2O3-ATP的飽和磁化強度為8.915 emu/g，較 Bourlinos等［16］磁性蒙脫土1.75 emu/g高，能夠迅速響應(yīng)外界磁場，使得γ-Fe2O3-ATP在使用過程中易于在外界磁場的作用下分離，這一點對固定化酶的回收和重復(fù)利用極為重要。

圖3 γ-Fe2O3-ATP磁滯回線Fig.3 Magnetic hysteresis loop of superparamagnetic γ-Fe2O3-attapulgite nanocomposites

2.2 脂肪酶固定化條件的研究

2.2.1 固定化時間的確定

圖4是在pH 7.0的磷酸緩沖液中考察固載時間對固定化酶活的影響結(jié)果。由圖4可知:在4 h之前酶活和固載率隨著時間的延長而增大，當(dāng)時間為4 h時酶活和固載率都達(dá)到最大。豬胰脂肪酶分子與γ-Fe2O3-ATP可能是通過范德華力、疏水作用相結(jié)合，在載體表面和孔道形成單分子層吸附，使得酶的活性中心能夠充分暴露出來，表現(xiàn)出較大的酶活［20］。4 h之后，酶活和固載率隨時間延長下降?？赡芤环矫媸侵久概c載體之間僅通過微弱的物理作用相結(jié)合，經(jīng)過長時間搖床固載后，使其又回到溶液中去，導(dǎo)致酶活下降。另一方面可能是因為固載環(huán)境不是無菌的，固載后期酶液中有H2S的氣味即是被細(xì)菌分解所致。

圖4 時間對酶固定化的影響Fig.4 Effects of time on PPL immobilization on γ-Fe2O3-ATP

2.2.2 體系pH的確定

圖5是在其他條件不變的情況下，考察體系pH對固定化酶活的影響結(jié)果。由圖5可知:當(dāng)pH為6.0時酶活和固載率最大，在pH值超過7.0后酶活和固載率急劇下降。這可能是因為蛋白質(zhì)在溶液中有兩性電離現(xiàn)象，當(dāng)溶液pH值低于蛋白質(zhì)等電點時，蛋白質(zhì)帶正電，反之蛋白質(zhì)帶負(fù)電。載體孔道內(nèi)表面由于帶有負(fù)電荷使其pH值比溶液中?。?1］。PPL 的等電點為 5.0［22］。當(dāng)溶液的 pH 在5.0～6.0之間時，由于載體孔道內(nèi)表面的pH值比溶液小，所以孔道內(nèi)的脂肪酶帶正電荷并隨著pH的增加而逐漸減少為零，酶分子之間的庫倫力隨之變?nèi)?，在載體的內(nèi)表面形成較緊密的單層排列［23］，在溶液pH為6.0時，可能是酶分子所帶電荷為0，酶分子之間斥力為0，酶活和固載率最高。當(dāng)pH在6.0～9.0之間時，可能是載體孔道pH大于酶分子等電點，酶分子帶負(fù)電荷，脂肪酶和載體內(nèi)表面都帶負(fù)電荷而相互排斥，固載率下降，酶活變低［20］。

圖5 pH對酶固定化的影響Fig.5 Effects of pH on PPL immobilization on γ-Fe2O3-ATP

2.3 固定化酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.3.1 固定化酶的熱穩(wěn)定性

圖6是將制備好的固定化酶和游離酶放置60℃環(huán)境中考察高溫對酶活的影響結(jié)果，并以各自未經(jīng)熱處理的初始酶活力為100%計。由圖6可知:隨著在60℃高溫環(huán)境下時間的延長，固定化酶和游離酶的酶活都呈下降趨勢，經(jīng)過6 h高溫保存后固定化酶保留初始酶活的52%，游離酶保留初始酶活的19%，固定化酶的剩余酶活高于游離酶，表明固定化酶有更好的熱穩(wěn)定性。推測原因可能是部分脂肪酶進(jìn)入材料的介孔中使得其在高溫中空間構(gòu)象得到孔道的束縛，酶活力得以保留。

圖6 高溫對固定化酶和游離酶的影響Fig.6 Effects of temperature on stability of immobilized lipase

2.3.2 固定化酶的重復(fù)利用性

在pH 7.0、溫度37℃的條件下，考察固定化酶的重復(fù)利用效果，結(jié)果見圖7。由圖7可知:隨著使用次數(shù)的增加酶活有所下降，在重復(fù)使用5次后比酶活仍達(dá)6000 U/g。原因一方面可能是利用了載體的磁性特點回收固定化酶避免了其他方法回收過程中的損失，另一方面可能是固定化酶機械強度較游離酶高，使其穩(wěn)定性提高。酶活有所下降可能是酶分子與γ-Fe2O3-ATP僅通過微弱的疏水作用和范德華力結(jié)合的，經(jīng)過多次分離洗滌，酶分子很容易脫落，造成酶活部分損失，但每次能回收完全且方便，所以就固定酶自身而言，其重復(fù)利用性能很理想。

圖7 使用次數(shù)對固定化酶的影響Fig.7 Reusability of immobilized lipase

3 結(jié)論

以自制γ-Fe2O3-ATP作為固定化豬胰脂肪酶的載體，其固定化最佳條件為固定化時間4 h及pH 6.0。制備的γ-Fe2O3-ATP比表面積為102.63 m2/g，發(fā)現(xiàn)能提高其固載率。其飽和磁化強度為8.915 emu/g，對外界磁場響應(yīng)更靈敏，能更好地解決傳質(zhì)及回收再利用問題。由此表明γ-Fe2O3-ATP是固定化酶的良好載體。由于保留了凹土的骨架結(jié)構(gòu)，γ-Fe2O3-ATP仍然具有凹土的性質(zhì)，可通過改性派生出各類衍生物，具有較好的應(yīng)用前景。

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