顏佳鋮，紀(jì)曉俊，聶志奎，鄧中濤，任路靜，黃 和

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009)

微生物油脂中花生四烯酸含量的準(zhǔn)確快速測(cè)定

顏佳鋮，紀(jì)曉俊，聶志奎，鄧中濤，任路靜，黃 和

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009)

建立了快速、準(zhǔn)確測(cè)定微生物油脂中花生四烯酸(ARA)含量的氣相色譜檢測(cè)方法。選用DB-23毛細(xì)管色譜柱，設(shè)置合適的載氣壓力，采用FID檢測(cè)器，對(duì)ARA含量進(jìn)行了定量分析。測(cè)定結(jié)果表明：油脂中各脂肪酸組分可有效分離，分析時(shí)間僅需20 min，ARA的回收率為90.146%～100.634%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.175%。

ARA；氣相色譜分析；微生物油脂

花生四烯酸(Arachidonic Acid，簡(jiǎn)稱ARA)屬于ω-6系列長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸。作為人體必需的多不飽和脂肪酸，是前列腺素(prostaglandin)、凝血惡烷(thromboxane)和白三烯(leucotriene)等類二十烷酸的前體物質(zhì)[1-4]。ARA具有多種生理活性，在醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[5]。

ARA普遍存在于陸地動(dòng)物的油脂中，但含量不高，無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的需求，采用微生物發(fā)酵是獲取ARA的方式之一[6]。目前，ARA分析檢測(cè)技術(shù)主要有甲酯化氣相色譜法[7]、高效液相色譜法[8]、薄層色譜法[9]及柱層析[10]等。其中應(yīng)用最為廣泛的是氣相色譜法。

脂肪酸含量的測(cè)定多采用面積歸一化法，但該法將各脂肪酸的校正因子視為相等，不能正確反映細(xì)胞內(nèi)ARA含量。而外標(biāo)法需要進(jìn)樣量精確，對(duì)進(jìn)樣技術(shù)要求較高。采用內(nèi)標(biāo)法可克服上述方法的缺陷，內(nèi)標(biāo)物選擇待測(cè)物中不含的脂肪酸，如奇數(shù)碳脂肪酸(C13∶0，C17∶0等)[11-12]。筆者采用內(nèi)標(biāo)法，以十三烷酸甲酯(C13∶0甲酯)為內(nèi)標(biāo)，DB-23為分離柱，建立測(cè)定微生物油脂中ARA含量的方法，以期實(shí)現(xiàn)ARA含量的快速準(zhǔn)確測(cè)定，滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

材料：微生物油脂，取高山被孢霉發(fā)酵中期提取的油脂。

標(biāo)準(zhǔn)試劑：ARA甲酯100 mg(純度99%)，ARA 甘油三酯100 mg(純度99%)，十三烷酸甲酯1 000 mg(純度97%)，均為色譜純?cè)噭?gòu)自Sigma公司。

試劑：0.5 mol/L KOH-CH3OH分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BF3-乙醚-甲醇溶液(V(BF3-乙醚)∶V(甲醇)=3∶7)分析純，其中BF3-乙醚購(gòu)自江蘇永華精細(xì)化學(xué)品有限公司；NaCl分析純，購(gòu)自西隴化工股份有限公司；正己烷色譜純，購(gòu)自山東禹王實(shí)業(yè)有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

在島津GC-2010氣相色譜儀上，用DB-23(60 mm×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱進(jìn)行分析，載氣為高純度N2，柱流1.56 mL/min，尾吹流速30 mL/min，H2流速30 mL/min，空氣流速400 mL/min，分流比為30∶1。

汽化室溫度為250 ℃，檢測(cè)器溫度為280 ℃，色譜柱初始溫度為100 ℃，以25 ℃/min升至196 ℃，再以2 ℃/min升至220 ℃，保持 6 min。進(jìn)樣量為1 μL；其中毛細(xì)管柱購(gòu)自安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

ARA甲酯儲(chǔ)備液的配制：取10 mL容量瓶，正己烷洗數(shù)次。稱取ARA 甲酯48.2 mg，用正己烷溶解后轉(zhuǎn)移至上述容量瓶中，定容、搖勻，得到ARA甲酯儲(chǔ)備液的質(zhì)量濃度為4.78 mg/mL。

C13∶0甲酯溶液的配制：取25 mL容量瓶，正己烷沖洗數(shù)次。稱取內(nèi)標(biāo)物C13∶0甲酯56.2 mg，正己烷溶解后轉(zhuǎn)移至該容量瓶中，定容、搖勻，所得內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度為2.18 mg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：按下表分別移取適量ARA甲酯儲(chǔ)備液于4個(gè)5 mL容量瓶中，加入正己烷稀釋至刻度，搖勻。連同ARA甲酯儲(chǔ)備液，可得到5種濃度的ARA甲酯溶液。

將上述溶液分裝于2 mL氣相進(jìn)樣瓶中，封口膠密封，做好標(biāo)記，備用。

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作液中ARA甲酯的含量Table 1 Content of ARA methyl esters in standard solution

1.2.2 試樣的制備

準(zhǔn)確稱取油脂試樣0.45～0.55 g，添加正己烷定容至10 mL，振蕩使其完全溶解后，取1 mL溶液于10 mL容量瓶中，加0.5 mol/L的KOH-CH3OH溶液3 mL，振蕩，65 ℃水浴15 min，冷卻至室溫后加入BF3-乙醚-甲醇溶液3 mL，振蕩，65 ℃水浴5 min。再次冷卻至室溫，加飽和NaCl溶液2 mL及正己烷1 mL，多次萃取上清，正己烷定容至10 mL容量瓶中，用于氣相色譜分析。

1.3 測(cè)定方法

采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量測(cè)定，內(nèi)標(biāo)物為C13∶0甲酯，200 μL待測(cè)試樣和200 μL內(nèi)標(biāo)品充分混合，用于氣相色譜分析。

微生物油脂中脂肪酸含量可換算為該脂肪酸占總油質(zhì)量的百分比，計(jì)算見(jiàn)式(1)。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)標(biāo)物與待測(cè)物的定性分析

將C13∶0甲酯和ARA甲酯分別進(jìn)行GC分析，得到二者的氣相色譜圖如圖1和圖2所示。

圖1 內(nèi)標(biāo)物C13∶0甲酯的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of C13∶0 methyl ester

圖2 ARA甲酯的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of ARA methyl ester

由以上2種純物質(zhì)的氣相色譜圖，可分別得到C13∶0甲酯和ARA甲酯的保留時(shí)間，其中內(nèi)標(biāo)物C13∶0甲酯的保留時(shí)間為7.555 min，ARA甲酯的保留時(shí)間為17.768 min。

2.2 ARA的定量分析

添加內(nèi)標(biāo)物的氣相色譜分離檢測(cè)圖如圖3所示。由圖3可知：2種脂肪酸分離效果良好，其他組分不干擾測(cè)定。

圖3 添加內(nèi)標(biāo)物的氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of fatty acids in microbial oils with internal-standard

2.2.1 相對(duì)校正因子的測(cè)定

分別取相同濃度的內(nèi)標(biāo)物C13∶0甲酯和不同質(zhì)量濃度的ARA甲酯各200 μL，其中C13∶0甲酯的質(zhì)量濃度為2.18 mg/mL，ARA甲酯的質(zhì)量濃度分別為4.78、2.39、1.20、0.48和0.24 mg/mL，混合均勻，每個(gè)試樣進(jìn)樣2次，取平均值，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 測(cè)定ARA甲酯相對(duì)C13∶0甲酯的相對(duì)校正因子Table 2 Determination of relative calibration factors of ARA methyl ester to C13∶0 methyl ester

注：該組數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是4.306 6%。

2.2.2 方法精確度的測(cè)定

取同一批油脂，精確稱取5份試樣，按1.2.2方法進(jìn)行試樣預(yù)處理后，按1.3方法進(jìn)行定量分析，進(jìn)樣2次，取平均值，精確度分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 微生物油脂試樣中ARA的精確度分析Table 3 Precision of method for detection of ARA in microorganism oil

注：該組數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.180%。

由表3可知：微生物油脂中ARA的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為274.026 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.180%。實(shí)驗(yàn)中由于試樣處理過(guò)程較復(fù)雜、采用手動(dòng)進(jìn)樣、儀器自身也存在誤差，導(dǎo)致數(shù)據(jù)存在誤差，但RSD值小于5%，表明此方法精確度較高，重現(xiàn)性好[13]。

2.2.3 回收率的測(cè)定

采用加標(biāo)回收法，準(zhǔn)確稱取已知ARA含量的油脂試樣5份，分別添加ARA甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。按1.2.2方法進(jìn)行試樣預(yù)處理后，按1.3定量分析方法進(jìn)行測(cè)定，回收率分析結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知：ARA的回收率為90.146%～100.634%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.175%，由于本方法前期處理過(guò)程相對(duì)比較復(fù)雜，回收率需要滿足90%～110%范圍，由此可見(jiàn)本組數(shù)據(jù)滿足該方法的要求。

表4 微生物油脂中ARA的回收率Table 4 Recoveries of ARA in microorganism oil

注：該組數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是4.175%。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)ARA的回收率為90.146%～100.634%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.175%，微生物發(fā)酵中期油脂中ARA的含量為274.026 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.180%，表明此方法的精確度高，可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)微生物油脂中ARA含量，具有檢測(cè)時(shí)間短、精確度高、可靠性好的優(yōu)點(diǎn)。因此為微生物油脂中脂肪酸的檢測(cè)提供了一個(gè)較為可行的分析方法，具有較高的實(shí)用性，并為發(fā)酵過(guò)程監(jiān)測(cè)和菌種誘變篩選提供了參考標(biāo)準(zhǔn)。

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(責(zé)任編輯 周曉薇)

Fast determination of arachidonic acid in microbial oils

YAN Jiacheng,JI Xiaojun,NIE Zhikui,DENG Zhongtao,REN Lujing,HUANG He

(State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering,College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 210009,China)

Gas chromatography was performed for the determination of arachidonic acid (ARA) produced by micro-organisms.Capillary column DB-23 was used with FID and suitable carrier gas for the detection.The result indicated that the method could separate fatty acids well in 20 min on good precision and recovery.The recovery rate of ARA was 90.146% to 100.634%,and the relative standard deviation was 4.175%.Thus,the method was effective for the detection of ARA produced by micro-organisms.

arachidonic acid;gas chromatography;microbial oils

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.02.013

2012-06-05

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2014AA021703);國(guó)家自然科學(xué)基金(21376002)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20131405)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程

顏佳鋮(1988—)，女，江蘇南通人，碩士研究生，研究方向：生物化工；紀(jì)曉俊(聯(lián)系人)，副教授，E-mail:xiaojunji@njtech.edu.cn

Q815

A

1672-3678(2014)02-0066-04