周曉潮，王春梅

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102)

隨著越來(lái)越多的原核生物基因組測(cè)序工作的完成，一些有趣的信息引起了科學(xué)界的關(guān)注，如原核中竟然存在大量絲氨酸/蘇氨酸激酶，它們是否與真核生物中的激酶一樣可作為細(xì)胞生長(zhǎng)分裂與分化的信號(hào)調(diào)控系統(tǒng)的組成部分?在已研究的21個(gè)藍(lán)藻菌株基因組中，發(fā)現(xiàn)了286個(gè)基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase，STPK)，其中，魚(yú)腥藻 7120(Anabaena sp.PCC 7120)含有52個(gè)基因編碼 STPK［1］。盡管這些STPK的功能大多還不明確，但如此大量的基因表明，其編碼的蛋白在藍(lán)藻細(xì)胞生命中一定起到了重要的作用。真核細(xì)胞中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族［2］，與細(xì)胞周期蛋白(cyclin)結(jié)合后被激活，可催化底物磷酸化［3］。CDKs在細(xì)胞周期循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，依序完成DNA合成和有絲分裂，引起細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖［4］。Roscovitine 是 CDC2/cyclin B、CDK2/cyclin A、CDK2/cyclin E、CDK5/p35的選擇性抑制劑?？筛?jìng)爭(zhēng)性地與CDKs的腺嘌呤位點(diǎn)結(jié)合，從而將細(xì)胞阻止于G1/S期和G2/M期，使細(xì)胞在G2期積累，最終導(dǎo)致死亡［5］。藍(lán)藻中也存在與CDKs基因序列同源性較高的激酶基因，這些藍(lán)藻中的激酶是否也與細(xì)胞分裂調(diào)控相關(guān)，本文考察了CDKs的抑制劑roscovitine對(duì)絲狀多細(xì)胞藍(lán)藻魚(yú)腥藻7120、單細(xì)胞藍(lán)藻集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC 6803)和聚球藻 7002(Synechococcus sp.PCC 7002)生長(zhǎng)的影響，將為進(jìn)一步揭示STPK在藍(lán)藻細(xì)胞分裂過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 絲狀藍(lán)藻魚(yú)腥藻7120(Anabaena sp.PCC 7120)由中國(guó)科學(xué)院植物研究所施定基博士贈(zèng)送，單細(xì)胞藍(lán)藻集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC 6803)、單細(xì)胞藍(lán)藻聚球藻7002(Synechococcus sp.PCC 7002)由中國(guó)科學(xué)院植物研究所黃芳博士贈(zèng)送;實(shí)驗(yàn)用試劑Roscovitine和二甲基亞砜(DMSO)為Sigma公司產(chǎn)品，MTT(3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide)為Amresco公司產(chǎn)品。

1.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 魚(yú)腥藻7120和集胞藻6803采用BG-11(加氮)培養(yǎng)基［6］，置于轉(zhuǎn)速為120 r/min，培養(yǎng)溫度(28±1)℃，光照強(qiáng)度約為80 μmol/m2/s的HPG-280BX光照控溫旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)中培養(yǎng)。聚球藻7002采用Medium A培養(yǎng)基，置于轉(zhuǎn)速為120 r/min，培養(yǎng)溫度(30±1)℃，光照強(qiáng)度約為80 μmol/m2/s的光照控溫旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取3種藻對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)物，接種于相應(yīng)的新鮮培養(yǎng)基中，起始OD750達(dá)0.3左右。將上述每種藻培養(yǎng)液分別加置A、B兩塊24孔板上，每孔培養(yǎng)體積1 mL。每塊板分別設(shè)置空白組、對(duì)照組、加藥組，每組3個(gè)平行?？瞻捉M分別為BG-11(加氮)或Medium A培養(yǎng)基，對(duì)照組為不加roscovitine的藻培養(yǎng)液，加藥組中 roscovitine的濃度分別為50、100、200和300 μmol/L。A板培養(yǎng)至4 h，B板培養(yǎng)至 4 d取樣。

1.2.2 顯微鏡下觀察藻細(xì)胞形態(tài) 取各組藻細(xì)胞液20 μL于玻片上，使用TE2000-S倒置顯微鏡(日本，Nikon)，在10倍目鏡、40倍物鏡下進(jìn)行觀察，照相。

1.2.3 不同濃度roscovitine對(duì)3種藻生長(zhǎng)的影響使用UV2100紫外分光光度計(jì)(美國(guó)，UNICO)測(cè)取波長(zhǎng)750 nm下，3種藻各組藻培養(yǎng)液的吸光度值［7］。

1.2.4 MTT法測(cè)3種藻的活力變化［8-9］從上述各板中每孔分別取300 μL藻培養(yǎng)液至1.5 mL EP管中，向培養(yǎng)液中加入100 μL濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液，轉(zhuǎn)速為120 r/min，培養(yǎng)溫度(35±1)℃，光照強(qiáng)度約為 80 μmol/m2/s，孵育 2.5 h。12000 r/min離心10 min，棄上清，向沉淀中加DMSO(A 板:150 μL;B 板:750 μL)，充分溶解。12000 r/min離心10 min，取上清100 μL 至96 孔板，使用ELx800酶標(biāo)儀(美國(guó)，BioTek)測(cè)取波長(zhǎng)490 nm下的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)觀察

圖1 roscovitine作用4 d對(duì)3種藍(lán)藻生長(zhǎng)的影響Fig.1 The effects of roscovitine on the growth of three species of cyanobacterial strains after treated 4 days

圖2 不同濃度roscovitine作用4 h和4 d對(duì)魚(yú)腥藻7120生長(zhǎng)的影響Fig.2 The effects of roscovitine on the growth of Anabaena sp.PCC 7120 after treated 4 hour or 4 days

如圖1所示，魚(yú)腥藻7120加藥組藻絲狀體較短，所含藻細(xì)胞數(shù)較少;對(duì)照組絲狀體較長(zhǎng)，所含藻細(xì)胞數(shù)較多。集胞藻6803和聚球藻7002加藥組與對(duì)照組比較，藻細(xì)胞在形態(tài)上無(wú)差別。

2.2 Roscovitine對(duì)魚(yú)腥藻7120生長(zhǎng)和活性的影響

研究了短期(4 h)和較長(zhǎng)期(4 d)roscovitine對(duì)3種藻的作用效果。藻液吸光度OD750數(shù)值反映了roscovitine對(duì)細(xì)胞數(shù)的影響。MTT檢測(cè)結(jié)果OD490數(shù)值反映了細(xì)胞的活性。如圖2A所示，加藥4 h，不同濃度roscovitine對(duì)魚(yú)腥藻7120的細(xì)胞數(shù)沒(méi)有影響，加藥4 d，濃度大于100 μmol/L的roscovitine對(duì)魚(yú)腥藻7120的細(xì)胞數(shù)具有明顯的降低作用(P＜0.05)，且 roscovitine濃度越高細(xì)胞數(shù)越少。圖2B顯示加藥4 h，濃度大于100 μmol/L的roscovitine對(duì)魚(yú)腥藻7120細(xì)胞活性有極顯著的抑制作用(P＜0.01)，且這種抑制作用呈劑量依賴性;加藥4 d 200 μmol/L的roscovitine對(duì)細(xì)胞活性有顯著的抑制作用(P＜0.05)，300 μmol/L的roscovitine對(duì)細(xì)胞活性有極顯著的抑制作用(P ＜0.01)。

2.3 Roscovitine對(duì)集胞藻6803生長(zhǎng)和活性的影響

圖3 不同濃度roscovitine作用4 h和4 d對(duì)集胞藻6803生長(zhǎng)的影響Fig.3 The effects of roscovitine on the growth of Synechocystis sp .PCC 6803 after treated 4 hour or 4 days

如圖 3A 所示，加藥 4 h，300 μmol/L 的roscovitine對(duì)集胞藻6803有輕微的刺激作用，短時(shí)間內(nèi)增加了細(xì)胞數(shù)(P＜0.05);加藥4 d，不同濃度的roscovitine均對(duì)集胞藻6803的細(xì)胞數(shù)具有極顯著的降低作用(P＜0.01)，且roscovitine濃度越高細(xì)胞數(shù)越少。圖3B顯示加藥4 h，不同濃度roscovitine對(duì)集胞藻6803細(xì)胞活性無(wú)顯著的抑制作用(P＞0.05);圖3C顯示加藥4 d，只有50 μmol/L的roscovitine對(duì)細(xì)胞活性促進(jìn)作用(P＜0.05)，其他濃度無(wú)影響。

2.4 Roscovitine對(duì)聚球藻7002生長(zhǎng)和活性的影響

如圖4A所示，加藥4 h，不同濃度的roscovitine均對(duì)聚球藻7002細(xì)胞數(shù)具有極顯著的增多作用 (P＜0.01)，且roscovitine濃度越高細(xì)胞數(shù)越多;加藥4 d，不同濃度roscovitine對(duì)聚球藻7002的細(xì)胞數(shù)無(wú)影響 (P＞0.05)。圖4B顯示加藥4 h，不同濃度 roscovitine對(duì)聚球藻7002細(xì)胞活性有顯著的增強(qiáng)作用 (P＜0.05)，且roscovitine濃度越高細(xì)胞活性越強(qiáng);圖4C顯示加藥4 d，不同濃度roscovitine對(duì)細(xì)胞活性無(wú)影響 (P＞0.05)。

圖4 不同濃度roscovitine作用4 h和4 d對(duì)聚球藻7002生長(zhǎng)的影響Fig.4 The effects of roscovitine on the growth of Synechococcus sp .PCC 7002 after treated 4 hour or 4 days

3 討論

本研究結(jié)果顯示，roscovitine抑制絲狀多細(xì)胞魚(yú)腥藻7120的活性，從而抑制藻的生長(zhǎng)。從形態(tài)上，長(zhǎng)時(shí)間作用后的魚(yú)腥藻7120藻絲體較短。roscovitine短時(shí)間作用對(duì)聚球藻7002的活性和生長(zhǎng)有刺激作用，但長(zhǎng)時(shí)間作用不顯著。對(duì)于單細(xì)胞集胞藻6803，雖然roscovitine并沒(méi)顯示出對(duì)其活性的抑制，但長(zhǎng)時(shí)間作用后藻的生長(zhǎng)受到抑制。從以上結(jié)果來(lái)看，roscovitine影響了藍(lán)藻的生長(zhǎng)。roscovitine對(duì)不同的藍(lán)藻表現(xiàn)出不同的影響，可能對(duì)于不同藍(lán)藻其作用靶點(diǎn)不同，表現(xiàn)出不同程度的效應(yīng)。roscovitine影響了每種藍(lán)藻細(xì)胞中的哪些激酶還有待深入研究。

對(duì)藍(lán)藻中激酶的功能研究已經(jīng)引起多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的注意。魚(yú)腥藻7120的PknA(Alr4366)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的在絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)上磷酸化的蛋白激酶，是藍(lán)藻正常生長(zhǎng)和分化所必需的［10］。pkn41(alr0709)和 pkn42(alr0710)參與氮代謝調(diào)控［11］，PknD(Alr4368)是固氮條件下正常生長(zhǎng)所必需的，可能參與異形胞與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞間氮代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸［12］。Pkn30和Pkn44用于合成異形胞特定糖脂 HGL2［13］，HepS(All2760)在異形胞多糖層的形成過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用［14］。pknE(alr3732)參與異形胞被膜的形成，并間接控制固氮作用［15］。pknH(alr1336)只在異形胞中表達(dá)，用于穩(wěn)定地連接異形胞與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞［16］。目前對(duì)于魚(yú)腥藻STPK的研究主要集中在細(xì)胞分化過(guò)程，異形胞形成和氮代謝調(diào)控三方面，關(guān)于STPK在細(xì)胞分裂過(guò)程中的作用未見(jiàn)報(bào)道，但細(xì)胞分裂過(guò)程與藍(lán)藻的生長(zhǎng)密切相關(guān)。在真核生物中STPK參與調(diào)控細(xì)胞分裂，那么在原核生物中STPK是否還具有這一作用呢?roscovitine是真核細(xì)胞分裂的抑制劑，在本研究中顯示能抑制魚(yú)腥藻7120的生長(zhǎng)，推測(cè)roscovitine可能抑制了藍(lán)藻細(xì)胞的分裂。roscovitine對(duì)魚(yú)腥藻7120生長(zhǎng)和活性的影響是通過(guò)抑制某一種或某一類(lèi)蛋白起作用的，其結(jié)構(gòu)和功能與真核細(xì)胞中的CDKs類(lèi)似，參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。因其與roscovitine結(jié)合活性受到影響，從而抑制了魚(yú)腥藻7120的生長(zhǎng)和活性。在 NCBI(National Center for Biotechnology Information)中對(duì)魚(yú)腥藻7120的總蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，尋找與人CDK1(NCBI登錄號(hào):P06493)、CDK2(NCBI登錄號(hào):CAA43985)和CDK5(NCBI登錄號(hào):CAG33322)類(lèi)似的蛋白激酶。檢索結(jié)果顯示，與人的CDK1進(jìn)行比對(duì)，有一個(gè)蛋白總分值最高，為82.0，相似度為30%;總分值在50～80的蛋白有20個(gè)，相似度在23% ～29%之間，其中包含已知的蛋白激酶PknE。與CDK2和CDK5進(jìn)行序列比對(duì)，總分值在50～80的蛋白分別有33和24個(gè)，相似度分別在24% ～31%和23% ～35%之間，其中已知的蛋白激酶有PknA、PknD和PknE。另外還有許多蛋白與CDK1、CDK2和CDK5有相對(duì)更低的相似性，分值小于50。上述所有蛋白均為絲氨酸/蘇氨酸激酶，而roscovitine很可能作用于這些蛋白中的某一個(gè)或幾個(gè)，從而抑制了魚(yú)腥藻7120的活性和分裂。此推測(cè)還有待進(jìn)一步深入研究確定。

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