胡文舉+宋艷畫+秦佳辰+石奎林+于文浩+劉遠哲+王新莊

摘要：為探索河南省郟縣紅牛產(chǎn)后子宮內(nèi)菌群變化規(guī)律及各菌種的致病性與耐藥性，采集21頭產(chǎn)后健康的郟縣紅牛子宮內(nèi)容物，進行了細菌計數(shù)、生化鑒定、致病性及藥敏試驗。結(jié)果表明，正常分娩后1 d牛子宮內(nèi)即呈現(xiàn)污染狀態(tài)，共分離出70株（9種）細菌，產(chǎn)后第8天子宮內(nèi)細菌數(shù)量和種類均達到最大值，分別為（1.88±0.65）×107個/g和79株（9種），隨后細菌數(shù)量和種類開始減少；產(chǎn)后第36天產(chǎn)吲哚金黃桿菌（Chryseobacterium indologenes）未分離到，第43天產(chǎn)吲哚金黃桿菌、乳房鏈球菌（Streptococcus uberis）、屎腸球菌（Enterococcus Faecium）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）4種細菌未分離到。小鼠致病性試驗結(jié)果表明，大腸埃希菌（Escherichia coli）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus）對小鼠致病性較強，大腸埃希菌組小鼠腹腔攻毒后24 h內(nèi)全部死亡，其余組小鼠在腹腔攻毒后2 d內(nèi)全部死亡。大腸埃希菌、蠟樣芽孢桿菌、藤黃微球菌、表皮葡萄球菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌均對阿莫西林和氨芐西林耐藥，對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、強力霉素、氯霉素、頭孢他啶均敏感。

關鍵詞：郟縣紅牛；子宮內(nèi)菌群；致病性；藥敏試驗

中圖分類號：S857.2+2；S858.23 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）17-4115-05

Intrauterine Flora Changes of Postpartum Cows and Its Pathogenicity

HU Wen-ju1，2； SONG Yan-hua3； QIN Jia-chen1； SHI Kui-lin4； YU Wen-hao1；

LIU Yuan-zhe1； WANG Xin-zhuang1

（1. Henan Agriculture University， Zhengzhou 450002， China；

2. Henan Radio & Television University， Zhengzhou， 450008， China；

3. Henan Vocational College of Agriculture， Zhongmou 451450， Henan， China；

4.Jiaxian Redcow Breeding Center of Pingdingshan City， Pingdingshan 467124， Henan， China）

Abstract： To study the flora changes of postpartum cows and the pathogenicity of bacteria and drug resistance， the uterine contents were collected from 21 health postpartum Jiaxian redcows for bacteria counting， biochemical identification， test of pathogenicity and drug resistance. The results showed that the uterus of cows were polluted one day after delivery and 70 strains （9 species） bacteria were isolated. The quantity and species of the bacteria reached the peak value （1.88±0.65×107/g and 79 strains（9 species）， then started falling. Chryseobacterium indologenes were not isolated 36 days after delivery and 43 days after delivery. There were four bacteria including Chryseobacterium indologenes， Streptococcus parauberis， Enterococcus faecium and Corpmbacterium were not isolated. Pathogenicity test showed that E.coli， Bacillus cereus， Micrococcus luteus and Staphylococcus epidermidis had high pathogenicity for mice. The mice in E.coli group died in 24 h after attack test， and in other groups died in 2 d. E.coli， Bacillus cereus， Micrococcus luteus， Staphylococcus epidermidis and Chryseobacterium indologenes were sensitive to ciprofloxacin， enrofloxacin， doxycycline， chloromycetin and ceftazidime but resistant to amoxicillin and ampicillin.

Key words： Jiaxian redcow； intrauterine flora； pathogenicity； drug sensitive test

隨著人工授精技術的普及和規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，子宮內(nèi)膜炎在母牛產(chǎn)科疾病中所占比例越來越大，致使良種母牛的繁殖潛力和生產(chǎn)性能無法充分發(fā)揮，給養(yǎng)牛業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失[1]。研究表明子宮內(nèi)膜炎是因為大量非致病性微生物侵入子宮后，在子宮內(nèi)過度繁殖引起的炎癥[2]，而產(chǎn)后牛子宮內(nèi)細菌的動態(tài)變化存在一個可預測的短暫規(guī)律[3]，因此研究產(chǎn)后牛子宮內(nèi)菌群的動態(tài)變化規(guī)律對預防和治療牛子宮內(nèi)膜炎有重要的意義。

本試驗對21頭產(chǎn)后健康的河南省郟縣紅牛不同時期子宮內(nèi)細菌進行了分離，并對分離出的9種細菌的致病性及耐藥性進行了研究，旨在探索郟縣紅牛產(chǎn)后子宮內(nèi)菌群變化規(guī)律，為臨床防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 動物 在河南平頂山地區(qū)某牛場選取產(chǎn)期相近的郟縣紅牛21頭，所選牛產(chǎn)程均正常、無胎衣不下，無繁殖障礙性病史，體況良好。昆白系小鼠40只（22～25 g/只），其中雌小鼠18只，雄小鼠22只，均購自河南省實驗動物中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 肉湯A培養(yǎng)基、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、血液瓊脂基礎培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、雙抗巧克力瓊脂培養(yǎng)基、改良沙氏瓊脂培養(yǎng)基、厭氧菌瓊脂、MH肉湯均為青島高科園海博生物技術有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 采集 分別于分娩后第1天（分娩當天記為0 d）、第8天、第15天、第22天、第29天、第36天、第43天進行子宮內(nèi)容物采集。用0.1%高錳酸鉀溶液對奶牛外陰部清洗消毒后，將連接有5 mL注射器的滅菌輸精管插入其子宮腔中，回抽子宮內(nèi)容物。將約2 mL子宮內(nèi)容物置于事先稱重并滅菌的50 mL三角瓶內(nèi)，再次稱重后加入少量滅菌生理鹽水，密封后置于含有冰塊的采樣箱內(nèi)，3 h內(nèi)帶回實驗室進行分離培養(yǎng)及相關檢測。

1.2.2 細菌計數(shù) 通過采樣前后三角瓶的質(zhì)量差，計算出所采集到的子宮內(nèi)容物質(zhì)量，然后在三角瓶中加入20 mL滅菌生理鹽水，充分搖勻后，繼續(xù)用滅菌生理鹽水定容至50 mL。取出1 mL定容后的液體，以10倍稀釋法依次稀釋樣品6次，每次稀釋完后從稀釋液中取出0.1 mL放入滅菌的平皿內(nèi)，立即倒入15 mL 45 ℃左右的1.5%營養(yǎng)瓊脂，晃動平皿使其混合均勻，待凝固后置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，選擇菌落數(shù)在30～300之間的平皿進行計數(shù)，每個樣品重復3次，取其平均值。細菌計數(shù)時排除有明顯子宮內(nèi)膜炎癥狀的樣品。

1.2.3 細菌的分離純化與鑒定 取1 mL定容后的菌液接入肉湯A培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后，分別劃線接種于血液瓊脂培養(yǎng)基、雙抗巧克力瓊脂培養(yǎng)基、改良沙氏瓊脂培養(yǎng)基和厭氧瓊脂中繼續(xù)培養(yǎng)。挑取生長狀態(tài)不同的單個菌落，革蘭氏染色、鏡檢，根據(jù)細菌的染色特性并結(jié)合菌落形態(tài)和生長特性進行初步判斷和分類，然后分別接種到相應的培養(yǎng)基上進行純化。挑取純化后的單個菌落采用全自動微生物鑒定及分析系統(tǒng)進行細菌的生化鑒定。

1.2.4 致病性試驗 將40只昆白系小鼠隨機均分成10組。第10組為對照組，其余各組腹腔內(nèi)分別注射1 mL各種純化后的細菌懸液（菌液濃度均調(diào)整為1.2×108 CFU/mL）。攻毒后注意觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食和死亡情況，及時剖解死亡小鼠，選取心、肝、脾等臟器進行細菌分離鑒定，檢驗是否與攻毒菌株相一致。

1.2.5 藥敏試驗 將待試菌株制成懸液，用滅菌生理鹽水調(diào)整比濁度，使其達到0.5麥氏單位，然后用MH肉湯按體積比1∶1 000稀釋備用。用菌液將藥物按兩倍稀釋法進行稀釋，使每行各孔的藥物濃度依次為128、64、32…0 μg/mL，然后將96孔塑料板置于各菌株最佳培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)18～24 h。以無細菌生長孔內(nèi)所含抗菌藥物的濃度為最低抑菌濃度（MIC）。每株細菌重復測定2次，結(jié)果取其平均值。

1.2.6 藥敏試驗結(jié)果判定 各菌種對不同藥物的耐藥、中敏、敏感臨界值按照美國臨床實驗室標準化研究所（CLSI）推薦的數(shù)值標準進行判定[4]。藥敏試驗中未列入CLSI推薦范圍的部分抗菌藥物，其結(jié)果判斷參考同類藥物標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)后牛子宮內(nèi)細菌數(shù)量的變化

牛子宮內(nèi)細菌計數(shù)結(jié)果見表1。從表1可以看出，正常分娩后1 d牛子宮內(nèi)即呈現(xiàn)污染狀態(tài)，到產(chǎn)后第8天其子宮內(nèi)細菌數(shù)量迅速增加，達到最大值（1.88±0.65）×107個/g，隨后細菌數(shù)量開始減少，產(chǎn)后第22天平均為（5.66±1.09）×104個/g，產(chǎn)后第29天平均為（2.58±0.47）×103個/g，從產(chǎn)后第29天到產(chǎn)后第43天牛子宮內(nèi)細菌數(shù)量處于緩慢減少的狀態(tài)。產(chǎn)后第36天有6頭牛未檢測到細菌存在，產(chǎn)后第43天有5頭牛檢測到細菌。產(chǎn)后第29天和第36天分別有2頭和1頭牛出現(xiàn)明顯子宮內(nèi)膜炎癥狀。

2.2 產(chǎn)后牛子宮內(nèi)細菌種類的變化

本試驗中，共分離出蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、產(chǎn)吲哚金黃桿菌（Chryseobacterium indologenes）等9種（311株）細菌。產(chǎn)后第1天共分離出70株細菌，產(chǎn)后第8天分離出的細菌株數(shù)最多，為79株，隨后分離出的細菌株數(shù)逐漸減少，第15天分離出63株，第22天分離出42株，第29天分離出30株，第36天分離出16株，第43天分離出11株。從分離出的細菌種類來看，產(chǎn)后第1天到第29天均為9種，第36天產(chǎn)吲哚金黃桿菌未分離到，第43天產(chǎn)吲哚金黃桿菌、乳房鏈球菌（Streptococcus uberis）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）4種細菌未分離到。分離出的藤黃微球菌（Micrococcus luteus）在各階段均有較高比例，最高達到了36.36%，其次是大腸埃希菌（Escherichia coli）、淺黃金色單胞菌（Chrysemonas luteola）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），表皮葡萄球菌（Staphylococcus）在產(chǎn)后第1天僅分離出5株，在其后的幾個階段該菌所占比例不斷增加，在產(chǎn)后第43天達到了27.27%。

2.3 攻毒小鼠臨床癥狀及致病性試驗結(jié)果

小鼠攻毒后4～12 h，均出現(xiàn)精神萎靡，食欲廢絕，渾身發(fā)抖等臨床癥狀，攻毒8 h后，開始出現(xiàn)小鼠死亡。大腸埃希菌組最先出現(xiàn)死亡病例，隨后小鼠死亡集中出現(xiàn)在攻毒后24～48 h，具體結(jié)果見表3。由表3可知，大腸埃希菌組小鼠在腹腔攻毒后24 h內(nèi)全部死亡，蠟樣芽孢桿菌、藤黃微球菌、表皮葡萄球菌組小鼠在腹腔攻毒后2 d內(nèi)全部死亡，其余攻毒組在攻毒后3 d內(nèi)出現(xiàn)部分小鼠死亡。對死亡小鼠解剖后進行細菌重分離，除淺黃金色單胞菌組外，其余各組均從病變臟器中回收到所接種的細菌。未死亡小鼠大部分在攻毒48 h后癥狀開始逐漸減輕，攻毒72 h后未死亡小鼠大部分恢復正常。對恢復正常的小鼠進行病原重分離，除棒狀桿菌屬外均未分離到接種菌；對未完全康復的小鼠進行病原重分離，除攻毒屎腸球菌組外其余均分離到接種菌。對死亡小鼠進行解剖，發(fā)現(xiàn)攻毒大腸埃希菌組小鼠病變最嚴重，均出現(xiàn)急性敗血癥，腹部脹氣，剖檢后可見小腸出現(xiàn)壞死，腸管脹氣并有大量黃色液體，脾臟和肝臟淤血并出現(xiàn)壞死，母鼠子宮也出現(xiàn)水腫、淤血等；攻毒其他菌種死亡小鼠腹腔內(nèi)有液體滲出，脾臟和肝臟出現(xiàn)部分壞死和出血點。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

選擇對小鼠致病性較強的大腸埃希菌、蠟樣芽孢桿菌、藤黃微球菌、表皮葡萄球菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌進行藥敏試驗，結(jié)果見表4。由表4可以看出，5種細菌均對阿莫西林和氨芐西林耐藥，對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、強力霉素、氯霉素、頭孢他啶敏感。此外，蠟樣芽孢桿菌還對慶大霉素、安普霉素、粘菌素和鏈霉素表現(xiàn)為耐藥；表皮葡萄球菌對粘菌素、青霉素、磺胺氯吡嗪鈉和林可霉素耐藥；大腸埃希菌對青霉素、林可霉素耐藥；藤黃微球菌對安普霉素、粘菌素、鏈霉素、磺胺氯吡嗪鈉和林可霉素耐藥；產(chǎn)吲哚金黃桿菌對青霉素耐藥。因此，在防治牛子宮內(nèi)膜炎時應盡量避免使用阿莫西林、氨芐西林、青霉素等藥物，可選擇環(huán)丙沙星、恩諾沙星等敏感藥物。

3 小結(jié)與討論

牛產(chǎn)后由于其子宮頸和陰道的開張，外界和陰道內(nèi)的微生物容易進入子宮腔內(nèi)，產(chǎn)后初期子宮腔及陰道內(nèi)的組織碎片和分泌物為微生物的繁殖提供營養(yǎng)，同時產(chǎn)后初期牛免疫力及子宮自凈能力低下，容易導致微生物的大量繁殖。張維軍等[5]的研究表明，奶牛產(chǎn)后第2天子宮內(nèi)呈現(xiàn)污染狀態(tài)，產(chǎn)后第8天子宮內(nèi)細菌計數(shù)達到最高，隨后開始緩慢下降；王國卿[6]研究認為產(chǎn)后第7天牛子宮內(nèi)細菌數(shù)量最多，此后由于惡露減少，子宮防御能力加強，子宮內(nèi)細菌數(shù)量逐漸減少，產(chǎn)后第39天子宮內(nèi)細菌數(shù)量不可計。該結(jié)論與本試驗結(jié)果相似。在機體健康時，大多數(shù)牛能憑借自身的防御系統(tǒng)，通過子宮的自凈功能排除病原微生物，在一定時期內(nèi)使子宮達到無菌狀態(tài)。劉春杰[7]認為健康牛在產(chǎn)后21 d內(nèi)通過子宮的自凈功能將子宮內(nèi)微生物排出體外，子宮開始呈現(xiàn)無菌狀態(tài)，產(chǎn)后46～60 d子宮的感染率會下降到9%以下。本試驗結(jié)果表明，產(chǎn)后第36天牛子宮內(nèi)逐漸呈現(xiàn)無菌狀態(tài)，產(chǎn)后第43天牛子宮感染率下降為26.31%。造成結(jié)果差異的原因可能與本試驗采樣牛場的飼養(yǎng)管理與飼料營養(yǎng)水平有關，本試驗采樣牛場飼養(yǎng)管理相對粗放，飼料營養(yǎng)水平低，因而造成環(huán)境微生物菌群復雜，機體免疫力低下。

目前普遍認為牛產(chǎn)后一段時間子宮處于一定的細菌污染狀態(tài)，但對于細菌的種類還沒有統(tǒng)一的結(jié)論。王國卿[6]的研究認為污染子宮的細菌主要有葡萄球菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、微球菌和鏈球菌；張維軍等[5]從產(chǎn)后健康奶牛子宮內(nèi)分離出的細菌主要有葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、變形桿菌、不動桿菌、梭狀芽孢桿菌等。本試驗分離到的細菌有蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌、表皮葡萄球菌、屎腸球菌、藤黃微球菌等9種細菌。各種報道的結(jié)果并不完全一致，這可能與地域、牛場環(huán)境、飼養(yǎng)管理及營養(yǎng)水平等因素有關。從細菌被清除出子宮的時間來看，產(chǎn)吲哚金黃桿菌在產(chǎn)后第36天即無法檢測到，產(chǎn)后第43天產(chǎn)吲哚金黃桿菌、乳房鏈球菌、屎腸球菌、棒狀桿菌屬4種細菌無法檢測到；藤黃微球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌3種細菌則隨著時間的延長，檢出率不斷提高。這說明牛子宮對產(chǎn)吲哚金黃桿菌、乳房鏈球菌、屎腸球菌、棒狀桿菌屬4種細菌的清除能力較強，而對藤黃微球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌3種細菌清除能力較弱，在牛子宮內(nèi)膜炎的預防過程中應給予重視。

將分離到的9種細菌進行小鼠致病性試驗，發(fā)現(xiàn)多數(shù)小鼠在攻毒后均表現(xiàn)出不同程度的精神萎靡，食欲廢絕，被毛粗亂，神經(jīng)癥狀包括后肢無力、四肢癱瘓和顫抖、抽搐等。生理鹽水對照組小鼠精神狀態(tài)良好，無異常癥狀。攻毒大腸埃希菌組8 h后，小鼠開始出現(xiàn)死亡病例，剖檢后發(fā)現(xiàn)小鼠腸管呈黃色稀軟狀并出現(xiàn)脹氣，子宮發(fā)生水腫，肝臟、脾臟呈現(xiàn)黑褐色，肺臟有出血點；攻毒蠟樣芽孢桿菌、藤黃微球菌、表皮葡萄球菌組剖檢后發(fā)現(xiàn)肝臟、脾臟出現(xiàn)淤血、水腫，但其他臟器無明顯病理變化。從對小鼠致死性來看，蠟樣芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、藤黃微球菌對小鼠的致病性較強，其中大腸埃希菌攻毒后1 d內(nèi)可使小鼠死亡。李正國等[1]、陳星等[8]均從患有子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮內(nèi)分離出大腸埃希菌；本試驗也從3例子宮內(nèi)膜炎患牛子宮中分離到了大腸埃希菌；這說明在牛子宮內(nèi)大腸埃希菌屬于條件性致病菌，當機體衰弱時可引起嚴重感染，并與其他疾病混合感染后引發(fā)子宮內(nèi)膜炎，嚴重者可引起全身疾病。

對小鼠致病性較強的蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌、大腸埃希菌、藤黃微球菌、表皮葡萄球菌5種細菌進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)5種細菌均對阿莫西林和氨芐西林產(chǎn)生耐藥性，對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、強力霉素、氯霉素、頭孢他啶敏感。這可能與養(yǎng)殖場長期頻繁使用阿莫西林和氨芐西林進行疾病治療有關。在治療子宮內(nèi)膜炎時建議不使用這兩種藥物。凌丁等[9]研究認為治療子宮內(nèi)膜炎時，交叉用藥、輪換用藥能夠防止細菌產(chǎn)生耐藥性，定期進行細菌的分離鑒定和藥敏試驗，確定子宮內(nèi)膜炎感染菌種，選擇最有效的藥物，才能達到最佳治療效果。

參考文獻：

[1] 李正國，宋華榮，易瑞卿，等.奶牛子宮內(nèi)膜炎主要病原菌的分離鑒定及中藥藥敏試驗[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2009，22（2）：463-466.

[2] 葛利江，田文儒，宜長和.母牛子宮內(nèi)膜免疫的調(diào)控[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2001（9）：31-32.

[3] 宜長和，任鳳杰，吳之杰，等.奶?；撔宰訉m內(nèi)膜炎子宮黏膜組織的抗原定位[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，1997（3）：1-2.

[4] CLSI/（NCCLS）.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing；Fourteenth Informational Supplement[S].2005.

[5] 張維軍，楊少華，高運東，等.產(chǎn)后健康奶牛子宮內(nèi)細菌動態(tài)變化規(guī)律的研究[J].家畜生態(tài)學報，2007，28（1）：86-91.

[6] 王國卿.產(chǎn)后健康奶牛和子宮內(nèi)膜炎患牛子宮內(nèi)細菌的研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2000.23-25.

[7] 劉春杰.阿魏酸鈉抗炎分子機制及對奶牛子宮內(nèi)膜炎療效初步觀察[D].長春：吉林大學，2013.6-7.

[8] 陳 星，胡松華，張克春，等.奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國獸醫(yī)雜志，2010，46（1）：43-44.

[9] 凌 丁，張業(yè)懷，莫文湛，等.南寧市郊奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌分離鑒定與耐藥性分析[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2013（5）：111-115.

2.3 攻毒小鼠臨床癥狀及致病性試驗結(jié)果

小鼠攻毒后4～12 h，均出現(xiàn)精神萎靡，食欲廢絕，渾身發(fā)抖等臨床癥狀，攻毒8 h后，開始出現(xiàn)小鼠死亡。大腸埃希菌組最先出現(xiàn)死亡病例，隨后小鼠死亡集中出現(xiàn)在攻毒后24～48 h，具體結(jié)果見表3。由表3可知，大腸埃希菌組小鼠在腹腔攻毒后24 h內(nèi)全部死亡，蠟樣芽孢桿菌、藤黃微球菌、表皮葡萄球菌組小鼠在腹腔攻毒后2 d內(nèi)全部死亡，其余攻毒組在攻毒后3 d內(nèi)出現(xiàn)部分小鼠死亡。對死亡小鼠解剖后進行細菌重分離，除淺黃金色單胞菌組外，其余各組均從病變臟器中回收到所接種的細菌。未死亡小鼠大部分在攻毒48 h后癥狀開始逐漸減輕，攻毒72 h后未死亡小鼠大部分恢復正常。對恢復正常的小鼠進行病原重分離，除棒狀桿菌屬外均未分離到接種菌；對未完全康復的小鼠進行病原重分離，除攻毒屎腸球菌組外其余均分離到接種菌。對死亡小鼠進行解剖，發(fā)現(xiàn)攻毒大腸埃希菌組小鼠病變最嚴重，均出現(xiàn)急性敗血癥，腹部脹氣，剖檢后可見小腸出現(xiàn)壞死，腸管脹氣并有大量黃色液體，脾臟和肝臟淤血并出現(xiàn)壞死，母鼠子宮也出現(xiàn)水腫、淤血等；攻毒其他菌種死亡小鼠腹腔內(nèi)有液體滲出，脾臟和肝臟出現(xiàn)部分壞死和出血點。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

選擇對小鼠致病性較強的大腸埃希菌、蠟樣芽孢桿菌、藤黃微球菌、表皮葡萄球菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌進行藥敏試驗，結(jié)果見表4。由表4可以看出，5種細菌均對阿莫西林和氨芐西林耐藥，對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、強力霉素、氯霉素、頭孢他啶敏感。此外，蠟樣芽孢桿菌還對慶大霉素、安普霉素、粘菌素和鏈霉素表現(xiàn)為耐藥；表皮葡萄球菌對粘菌素、青霉素、磺胺氯吡嗪鈉和林可霉素耐藥；大腸埃希菌對青霉素、林可霉素耐藥；藤黃微球菌對安普霉素、粘菌素、鏈霉素、磺胺氯吡嗪鈉和林可霉素耐藥；產(chǎn)吲哚金黃桿菌對青霉素耐藥。因此，在防治牛子宮內(nèi)膜炎時應盡量避免使用阿莫西林、氨芐西林、青霉素等藥物，可選擇環(huán)丙沙星、恩諾沙星等敏感藥物。

3 小結(jié)與討論

牛產(chǎn)后由于其子宮頸和陰道的開張，外界和陰道內(nèi)的微生物容易進入子宮腔內(nèi)，產(chǎn)后初期子宮腔及陰道內(nèi)的組織碎片和分泌物為微生物的繁殖提供營養(yǎng)，同時產(chǎn)后初期牛免疫力及子宮自凈能力低下，容易導致微生物的大量繁殖。張維軍等[5]的研究表明，奶牛產(chǎn)后第2天子宮內(nèi)呈現(xiàn)污染狀態(tài)，產(chǎn)后第8天子宮內(nèi)細菌計數(shù)達到最高，隨后開始緩慢下降；王國卿[6]研究認為產(chǎn)后第7天牛子宮內(nèi)細菌數(shù)量最多，此后由于惡露減少，子宮防御能力加強，子宮內(nèi)細菌數(shù)量逐漸減少，產(chǎn)后第39天子宮內(nèi)細菌數(shù)量不可計。該結(jié)論與本試驗結(jié)果相似。在機體健康時，大多數(shù)牛能憑借自身的防御系統(tǒng)，通過子宮的自凈功能排除病原微生物，在一定時期內(nèi)使子宮達到無菌狀態(tài)。劉春杰[7]認為健康牛在產(chǎn)后21 d內(nèi)通過子宮的自凈功能將子宮內(nèi)微生物排出體外，子宮開始呈現(xiàn)無菌狀態(tài)，產(chǎn)后46～60 d子宮的感染率會下降到9%以下。本試驗結(jié)果表明，產(chǎn)后第36天牛子宮內(nèi)逐漸呈現(xiàn)無菌狀態(tài)，產(chǎn)后第43天牛子宮感染率下降為26.31%。造成結(jié)果差異的原因可能與本試驗采樣牛場的飼養(yǎng)管理與飼料營養(yǎng)水平有關，本試驗采樣牛場飼養(yǎng)管理相對粗放，飼料營養(yǎng)水平低，因而造成環(huán)境微生物菌群復雜，機體免疫力低下。

目前普遍認為牛產(chǎn)后一段時間子宮處于一定的細菌污染狀態(tài)，但對于細菌的種類還沒有統(tǒng)一的結(jié)論。王國卿[6]的研究認為污染子宮的細菌主要有葡萄球菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、微球菌和鏈球菌；張維軍等[5]從產(chǎn)后健康奶牛子宮內(nèi)分離出的細菌主要有葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、變形桿菌、不動桿菌、梭狀芽孢桿菌等。本試驗分離到的細菌有蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌、表皮葡萄球菌、屎腸球菌、藤黃微球菌等9種細菌。各種報道的結(jié)果并不完全一致，這可能與地域、牛場環(huán)境、飼養(yǎng)管理及營養(yǎng)水平等因素有關。從細菌被清除出子宮的時間來看，產(chǎn)吲哚金黃桿菌在產(chǎn)后第36天即無法檢測到，產(chǎn)后第43天產(chǎn)吲哚金黃桿菌、乳房鏈球菌、屎腸球菌、棒狀桿菌屬4種細菌無法檢測到；藤黃微球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌3種細菌則隨著時間的延長，檢出率不斷提高。這說明牛子宮對產(chǎn)吲哚金黃桿菌、乳房鏈球菌、屎腸球菌、棒狀桿菌屬4種細菌的清除能力較強，而對藤黃微球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌3種細菌清除能力較弱，在牛子宮內(nèi)膜炎的預防過程中應給予重視。

將分離到的9種細菌進行小鼠致病性試驗，發(fā)現(xiàn)多數(shù)小鼠在攻毒后均表現(xiàn)出不同程度的精神萎靡，食欲廢絕，被毛粗亂，神經(jīng)癥狀包括后肢無力、四肢癱瘓和顫抖、抽搐等。生理鹽水對照組小鼠精神狀態(tài)良好，無異常癥狀。攻毒大腸埃希菌組8 h后，小鼠開始出現(xiàn)死亡病例，剖檢后發(fā)現(xiàn)小鼠腸管呈黃色稀軟狀并出現(xiàn)脹氣，子宮發(fā)生水腫，肝臟、脾臟呈現(xiàn)黑褐色，肺臟有出血點；攻毒蠟樣芽孢桿菌、藤黃微球菌、表皮葡萄球菌組剖檢后發(fā)現(xiàn)肝臟、脾臟出現(xiàn)淤血、水腫，但其他臟器無明顯病理變化。從對小鼠致死性來看，蠟樣芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、藤黃微球菌對小鼠的致病性較強，其中大腸埃希菌攻毒后1 d內(nèi)可使小鼠死亡。李正國等[1]、陳星等[8]均從患有子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮內(nèi)分離出大腸埃希菌；本試驗也從3例子宮內(nèi)膜炎患牛子宮中分離到了大腸埃希菌；這說明在牛子宮內(nèi)大腸埃希菌屬于條件性致病菌，當機體衰弱時可引起嚴重感染，并與其他疾病混合感染后引發(fā)子宮內(nèi)膜炎，嚴重者可引起全身疾病。

對小鼠致病性較強的蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌、大腸埃希菌、藤黃微球菌、表皮葡萄球菌5種細菌進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)5種細菌均對阿莫西林和氨芐西林產(chǎn)生耐藥性，對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、強力霉素、氯霉素、頭孢他啶敏感。這可能與養(yǎng)殖場長期頻繁使用阿莫西林和氨芐西林進行疾病治療有關。在治療子宮內(nèi)膜炎時建議不使用這兩種藥物。凌丁等[9]研究認為治療子宮內(nèi)膜炎時，交叉用藥、輪換用藥能夠防止細菌產(chǎn)生耐藥性，定期進行細菌的分離鑒定和藥敏試驗，確定子宮內(nèi)膜炎感染菌種，選擇最有效的藥物，才能達到最佳治療效果。

參考文獻：

[1] 李正國，宋華榮，易瑞卿，等.奶牛子宮內(nèi)膜炎主要病原菌的分離鑒定及中藥藥敏試驗[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2009，22（2）：463-466.

[2] 葛利江，田文儒，宜長和.母牛子宮內(nèi)膜免疫的調(diào)控[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2001（9）：31-32.

[3] 宜長和，任鳳杰，吳之杰，等.奶?；撔宰訉m內(nèi)膜炎子宮黏膜組織的抗原定位[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，1997（3）：1-2.

[4] CLSI/（NCCLS）.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing；Fourteenth Informational Supplement[S].2005.

[5] 張維軍，楊少華，高運東，等.產(chǎn)后健康奶牛子宮內(nèi)細菌動態(tài)變化規(guī)律的研究[J].家畜生態(tài)學報，2007，28（1）：86-91.

[6] 王國卿.產(chǎn)后健康奶牛和子宮內(nèi)膜炎患牛子宮內(nèi)細菌的研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2000.23-25.

[7] 劉春杰.阿魏酸鈉抗炎分子機制及對奶牛子宮內(nèi)膜炎療效初步觀察[D].長春：吉林大學，2013.6-7.

[8] 陳 星，胡松華，張克春，等.奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國獸醫(yī)雜志，2010，46（1）：43-44.

[9] 凌 丁，張業(yè)懷，莫文湛，等.南寧市郊奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌分離鑒定與耐藥性分析[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2013（5）：111-115.

2.3 攻毒小鼠臨床癥狀及致病性試驗結(jié)果

小鼠攻毒后4～12 h，均出現(xiàn)精神萎靡，食欲廢絕，渾身發(fā)抖等臨床癥狀，攻毒8 h后，開始出現(xiàn)小鼠死亡。大腸埃希菌組最先出現(xiàn)死亡病例，隨后小鼠死亡集中出現(xiàn)在攻毒后24～48 h，具體結(jié)果見表3。由表3可知，大腸埃希菌組小鼠在腹腔攻毒后24 h內(nèi)全部死亡，蠟樣芽孢桿菌、藤黃微球菌、表皮葡萄球菌組小鼠在腹腔攻毒后2 d內(nèi)全部死亡，其余攻毒組在攻毒后3 d內(nèi)出現(xiàn)部分小鼠死亡。對死亡小鼠解剖后進行細菌重分離，除淺黃金色單胞菌組外，其余各組均從病變臟器中回收到所接種的細菌。未死亡小鼠大部分在攻毒48 h后癥狀開始逐漸減輕，攻毒72 h后未死亡小鼠大部分恢復正常。對恢復正常的小鼠進行病原重分離，除棒狀桿菌屬外均未分離到接種菌；對未完全康復的小鼠進行病原重分離，除攻毒屎腸球菌組外其余均分離到接種菌。對死亡小鼠進行解剖，發(fā)現(xiàn)攻毒大腸埃希菌組小鼠病變最嚴重，均出現(xiàn)急性敗血癥，腹部脹氣，剖檢后可見小腸出現(xiàn)壞死，腸管脹氣并有大量黃色液體，脾臟和肝臟淤血并出現(xiàn)壞死，母鼠子宮也出現(xiàn)水腫、淤血等；攻毒其他菌種死亡小鼠腹腔內(nèi)有液體滲出，脾臟和肝臟出現(xiàn)部分壞死和出血點。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

選擇對小鼠致病性較強的大腸埃希菌、蠟樣芽孢桿菌、藤黃微球菌、表皮葡萄球菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌進行藥敏試驗，結(jié)果見表4。由表4可以看出，5種細菌均對阿莫西林和氨芐西林耐藥，對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、強力霉素、氯霉素、頭孢他啶敏感。此外，蠟樣芽孢桿菌還對慶大霉素、安普霉素、粘菌素和鏈霉素表現(xiàn)為耐藥；表皮葡萄球菌對粘菌素、青霉素、磺胺氯吡嗪鈉和林可霉素耐藥；大腸埃希菌對青霉素、林可霉素耐藥；藤黃微球菌對安普霉素、粘菌素、鏈霉素、磺胺氯吡嗪鈉和林可霉素耐藥；產(chǎn)吲哚金黃桿菌對青霉素耐藥。因此，在防治牛子宮內(nèi)膜炎時應盡量避免使用阿莫西林、氨芐西林、青霉素等藥物，可選擇環(huán)丙沙星、恩諾沙星等敏感藥物。

3 小結(jié)與討論

牛產(chǎn)后由于其子宮頸和陰道的開張，外界和陰道內(nèi)的微生物容易進入子宮腔內(nèi)，產(chǎn)后初期子宮腔及陰道內(nèi)的組織碎片和分泌物為微生物的繁殖提供營養(yǎng)，同時產(chǎn)后初期牛免疫力及子宮自凈能力低下，容易導致微生物的大量繁殖。張維軍等[5]的研究表明，奶牛產(chǎn)后第2天子宮內(nèi)呈現(xiàn)污染狀態(tài)，產(chǎn)后第8天子宮內(nèi)細菌計數(shù)達到最高，隨后開始緩慢下降；王國卿[6]研究認為產(chǎn)后第7天牛子宮內(nèi)細菌數(shù)量最多，此后由于惡露減少，子宮防御能力加強，子宮內(nèi)細菌數(shù)量逐漸減少，產(chǎn)后第39天子宮內(nèi)細菌數(shù)量不可計。該結(jié)論與本試驗結(jié)果相似。在機體健康時，大多數(shù)牛能憑借自身的防御系統(tǒng)，通過子宮的自凈功能排除病原微生物，在一定時期內(nèi)使子宮達到無菌狀態(tài)。劉春杰[7]認為健康牛在產(chǎn)后21 d內(nèi)通過子宮的自凈功能將子宮內(nèi)微生物排出體外，子宮開始呈現(xiàn)無菌狀態(tài)，產(chǎn)后46～60 d子宮的感染率會下降到9%以下。本試驗結(jié)果表明，產(chǎn)后第36天牛子宮內(nèi)逐漸呈現(xiàn)無菌狀態(tài)，產(chǎn)后第43天牛子宮感染率下降為26.31%。造成結(jié)果差異的原因可能與本試驗采樣牛場的飼養(yǎng)管理與飼料營養(yǎng)水平有關，本試驗采樣牛場飼養(yǎng)管理相對粗放，飼料營養(yǎng)水平低，因而造成環(huán)境微生物菌群復雜，機體免疫力低下。

目前普遍認為牛產(chǎn)后一段時間子宮處于一定的細菌污染狀態(tài)，但對于細菌的種類還沒有統(tǒng)一的結(jié)論。王國卿[6]的研究認為污染子宮的細菌主要有葡萄球菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、微球菌和鏈球菌；張維軍等[5]從產(chǎn)后健康奶牛子宮內(nèi)分離出的細菌主要有葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、變形桿菌、不動桿菌、梭狀芽孢桿菌等。本試驗分離到的細菌有蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌、表皮葡萄球菌、屎腸球菌、藤黃微球菌等9種細菌。各種報道的結(jié)果并不完全一致，這可能與地域、牛場環(huán)境、飼養(yǎng)管理及營養(yǎng)水平等因素有關。從細菌被清除出子宮的時間來看，產(chǎn)吲哚金黃桿菌在產(chǎn)后第36天即無法檢測到，產(chǎn)后第43天產(chǎn)吲哚金黃桿菌、乳房鏈球菌、屎腸球菌、棒狀桿菌屬4種細菌無法檢測到；藤黃微球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌3種細菌則隨著時間的延長，檢出率不斷提高。這說明牛子宮對產(chǎn)吲哚金黃桿菌、乳房鏈球菌、屎腸球菌、棒狀桿菌屬4種細菌的清除能力較強，而對藤黃微球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌3種細菌清除能力較弱，在牛子宮內(nèi)膜炎的預防過程中應給予重視。

將分離到的9種細菌進行小鼠致病性試驗，發(fā)現(xiàn)多數(shù)小鼠在攻毒后均表現(xiàn)出不同程度的精神萎靡，食欲廢絕，被毛粗亂，神經(jīng)癥狀包括后肢無力、四肢癱瘓和顫抖、抽搐等。生理鹽水對照組小鼠精神狀態(tài)良好，無異常癥狀。攻毒大腸埃希菌組8 h后，小鼠開始出現(xiàn)死亡病例，剖檢后發(fā)現(xiàn)小鼠腸管呈黃色稀軟狀并出現(xiàn)脹氣，子宮發(fā)生水腫，肝臟、脾臟呈現(xiàn)黑褐色，肺臟有出血點；攻毒蠟樣芽孢桿菌、藤黃微球菌、表皮葡萄球菌組剖檢后發(fā)現(xiàn)肝臟、脾臟出現(xiàn)淤血、水腫，但其他臟器無明顯病理變化。從對小鼠致死性來看，蠟樣芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、藤黃微球菌對小鼠的致病性較強，其中大腸埃希菌攻毒后1 d內(nèi)可使小鼠死亡。李正國等[1]、陳星等[8]均從患有子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮內(nèi)分離出大腸埃希菌；本試驗也從3例子宮內(nèi)膜炎患牛子宮中分離到了大腸埃希菌；這說明在牛子宮內(nèi)大腸埃希菌屬于條件性致病菌，當機體衰弱時可引起嚴重感染，并與其他疾病混合感染后引發(fā)子宮內(nèi)膜炎，嚴重者可引起全身疾病。

對小鼠致病性較強的蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌、大腸埃希菌、藤黃微球菌、表皮葡萄球菌5種細菌進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)5種細菌均對阿莫西林和氨芐西林產(chǎn)生耐藥性，對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、強力霉素、氯霉素、頭孢他啶敏感。這可能與養(yǎng)殖場長期頻繁使用阿莫西林和氨芐西林進行疾病治療有關。在治療子宮內(nèi)膜炎時建議不使用這兩種藥物。凌丁等[9]研究認為治療子宮內(nèi)膜炎時，交叉用藥、輪換用藥能夠防止細菌產(chǎn)生耐藥性，定期進行細菌的分離鑒定和藥敏試驗，確定子宮內(nèi)膜炎感染菌種，選擇最有效的藥物，才能達到最佳治療效果。

參考文獻：

[1] 李正國，宋華榮，易瑞卿，等.奶牛子宮內(nèi)膜炎主要病原菌的分離鑒定及中藥藥敏試驗[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2009，22（2）：463-466.

[2] 葛利江，田文儒，宜長和.母牛子宮內(nèi)膜免疫的調(diào)控[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2001（9）：31-32.

[3] 宜長和，任鳳杰，吳之杰，等.奶?；撔宰訉m內(nèi)膜炎子宮黏膜組織的抗原定位[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，1997（3）：1-2.

[4] CLSI/（NCCLS）.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing；Fourteenth Informational Supplement[S].2005.

[5] 張維軍，楊少華，高運東，等.產(chǎn)后健康奶牛子宮內(nèi)細菌動態(tài)變化規(guī)律的研究[J].家畜生態(tài)學報，2007，28（1）：86-91.

[6] 王國卿.產(chǎn)后健康奶牛和子宮內(nèi)膜炎患牛子宮內(nèi)細菌的研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2000.23-25.

[7] 劉春杰.阿魏酸鈉抗炎分子機制及對奶牛子宮內(nèi)膜炎療效初步觀察[D].長春：吉林大學，2013.6-7.

[8] 陳 星，胡松華，張克春，等.奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國獸醫(yī)雜志，2010，46（1）：43-44.

[9] 凌 丁，張業(yè)懷，莫文湛，等.南寧市郊奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌分離鑒定與耐藥性分析[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2013（5）：111-115.