涂金蘭?蔡絢?尹航?楊信定?何雨?石白冰

[摘要]目的 鑒別復(fù)方四季青軟膏中各主藥的真?zhèn)危谎芯繌?fù)方四季青軟膏的制備方法；建立復(fù)方四季青軟膏含量的控制方法。 方法 以薄層色譜法鑒別四季青葉、大黃、紫草；以紫外分光光度法測(cè)定紫草中左旋紫草素的含量。 結(jié)果 左旋紫草素的乙醇溶液在5.64～33.87μg/mL范圍內(nèi)，A與C呈良好線性關(guān)系，r=0.9999（n=6），平均回收率為98.80%，RSD（%）=0.88（n=6）。 結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，重現(xiàn)線好，可用于復(fù)方四季青軟膏中紫草含量的控制。

[關(guān)鍵詞] 復(fù)方四季青軟膏；含量測(cè)定；左旋紫草素

[中圖分類號(hào)] R927 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）18-29-05

復(fù)方四季青軟膏（原藥名紫柄冬青藥膏）為我院20世紀(jì)70年代燒傷科長(zhǎng)期使用的外用制劑，臨床用于治療燒、燙傷、止痛、生肌活血等 ，該制劑療效確切，用藥安全，長(zhǎng)期使用，未發(fā)現(xiàn)毒副作用，藥材資源豐富，價(jià)格低廉。是我院沿用了多年的有效經(jīng)驗(yàn)方[1]。紫草是復(fù)方四季青軟膏中的君藥 ，紫草性味甘、咸寒，具有涼血活血，解毒透疹的功效。是其最主要的藥理作用[2]。主要成分為萘醌類色素和多糖類化合物。紫草具有涼血、活血、解毒透疹的功效、熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、瘡瘍、濕疹、水火燙傷?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紫草具有較好的抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗過(guò)敏、保肝降酶等作用，是一種藥用價(jià)值很高的植物[3]。

四季青為冬青科植物冬青（Ilie purpurea Hasr）的干燥葉，始載于唐《本草拾遺》（紫柄冬青即為四季青，為貴州習(xí)慣用名）。性涼，味苦、微澀。具有清熱解毒、涼血止血、收斂生肌等功效。臨床上主要用于肺炎、急性咽喉炎癥、痢疾、膽道感染、外治燒傷、

下肢潰瘍、皮炎、濕疹、手腳皸裂等。其主要成分有：酚酸類、三萜及三萜皂苷類、黃酮類、揮發(fā)油類以及鞣質(zhì)等[4]。

大黃為蓼科多年生草本植物掌葉大黃、唐古特大黃或藥用大黃的干燥根及根莖。本品味苦、性寒，具有攻積滯、導(dǎo)濕熱、瀉火、涼血、祛瘀、解毒等功效[5]。大黃功效獨(dú)特，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有導(dǎo)瀉、利膽、保肝、抗菌、抗病毒、抗炎、止血、降脂、抗腫瘤等多種生物活性。其中，瀉下作用是其最主要的藥理作用。已有研究表明：生大黃瀉下作用峻烈，經(jīng)酒制后其苦寒瀉下作用稍緩；經(jīng)酒蒸后，瀉下作用緩和，并能增強(qiáng)活血祛瘀之功。大黃炭瀉下作用極微，并具有涼血化瘀止血作用[6]。

復(fù)方四季青軟膏中諸藥配伍，協(xié)同增效，療效顯著，具有清熱解毒、消腫止痛、收斂生肌的功效。為控制其制劑質(zhì)量，我們選擇紫草作為該制劑含量測(cè)定指標(biāo)，參考中華人民共和國(guó)2010年版藥典及相關(guān)文獻(xiàn)，采用薄層色譜法鑒別了四季青、大黃、紫草等藥材[7]，并用紫外分光光度法 建立了復(fù)方四季青軟膏的質(zhì)量控制方法[8-11]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 UV-2501型-紫外分光光度計(jì)（日本島津企業(yè)管理有限公司）、METTLER-AE240型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）、LX-02型100克多功能粉碎機(jī)（上海江信科技有限公司）、HS102600D型超聲波清洗機(jī)（天津奧泰儀器有限公司）、HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）、硅膠GF254薄層板（青島海洋化工有限公司）、硅膠G薄層板（自制）、以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠H薄層版（青島海洋化工）。

1.1.2 藥材 四季青（Ilicis Chinensis Folium，自采）、大黃（Radix et Rhizoma Rhei，貴州同濟(jì)堂制藥有限公司）、大黃（對(duì)照藥材，中國(guó)藥品生物制品檢定所，鑒別用）、紫草（Radix Arnebiae，貴州同濟(jì)堂制藥有限公司）、紫草（對(duì)照藥材，中國(guó)藥品生物制品檢定所，鑒別用）、金銀花（Flos Lonicerae Japonicae， 貴州同濟(jì)堂制藥有限公司）、延胡索（Rhizoma Corydacis， 貴州同濟(jì)堂制藥有限公司）、冰片（貴州同濟(jì)堂制藥有限公司）。

1.1.3 試劑 左旋紫草素對(duì)照品（0769-9903，中國(guó)藥品生物制品檢定所，含量測(cè)定用）、四季青對(duì)照品（長(zhǎng)梗冬青苷，111868-201001中國(guó)藥品生物制品檢定所）、大黃對(duì)照品（大黃素，110756-200110大黃酚，110796-201017中國(guó)藥品生物制品檢定所）、黃凡士林（南昌白云藥業(yè)有限公司）、復(fù)方四季青軟膏由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科制劑室提供；硅藻土（化學(xué)純，成都市科龍化工試劑廠）；其余試劑均為分析純；所用水均為純化水。

1.2 方法

1.2.1 處方 四季青葉100g，大黃80g， 紫草60g，金銀花40g，延胡索20g，冰片4g，黃凡士林1000g。

1.2.2 制法 先稱取200g黃凡士林加熱熔化，加紫草60g以文火煎1h，用4層紗布濾過(guò)，濾液與殘?jiān)魝溆谩Ｔ賹?00g的黃凡士林加熱熔化，加處方量的大黃、延胡索以文火煎至焦黃后加處方量的金銀花、四季青葉及上述紫草殘?jiān)晕幕鸺?h，用4層紗布濾過(guò)，合并兩次濾液，稍冷后加入冰片4g，攪拌使其完全溶解，放冷，分裝，即得。

1.2.3 藥材鑒別 （1）四季青葉的定性鑒別。取本品粉末3g，加乙酸乙酯60mL，超聲處理30min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL溶解，作為供試品溶液。另取長(zhǎng)梗東青苷對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含1mg的甲醇溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，用毛細(xì)管分別吸取上述兩種溶液適量，分別點(diǎn)與同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（7∶1∶0.2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈（254nm）下檢視，供試品色譜中，在于對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；噴以1%的香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。（2）大黃的定性鑒別。取本品粉末0.1g，加甲醇20mL，浸泡1h，濾過(guò)，取濾液5mL，蒸干，殘?jiān)铀?0mL溶解，再加鹽酸1mL加熱回流30min，立即冷卻，用乙醚分兩次振搖提取，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄?mL使溶解，作為供試品溶液。另取大黃對(duì)照藥材0.1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取大黃素對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含1mg的甲醇溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，用毛細(xì)管吸取上述三種溶液適量，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠H薄層版上，以石油醚（30～60℃）-甲酸甲酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)，置氨蒸氣中熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榧t色。（3）紫草的定性鑒別。取本品粉末0.5g，加石油醚（60～90℃）20mL，超聲處理20min，濾過(guò)，濾液濃縮至1mL，作為供試品溶液。另取紫草對(duì)照藥材0.5g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，用毛細(xì)管吸取兩種溶液適量，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶5∶0.5∶0.1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)；再噴以10%的氫氧化鉀甲醇溶液，斑點(diǎn)均變?yōu)樗{(lán)色。endprint

2 含量測(cè)定

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取（1/10萬(wàn)天平）左旋紫草素對(duì)照品5.04mg，置50mL容量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

稱取本品5g，置小燒杯中，加硅藻土5g，攪勻后移至具塞錐形瓶中，加100mL乙醇，于50℃水浴中 ，超聲40min，放冷，靜置，濾過(guò)，精密取續(xù)濾液5mL至25mL量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 左旋紫草素對(duì)照品最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

取左旋紫草素對(duì)照品乙醇液，以乙醇為空白對(duì)照，在600～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，左旋紫草素對(duì)照品在516nm處有最大吸收。見(jiàn)圖1。

2.4 樣品紫外吸收?qǐng)D測(cè)定

取樣品5g， 按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作，在UV-2501紫外分光光度計(jì)上于600～400nm波長(zhǎng)處掃描，516nm處有最大吸收。見(jiàn)圖2。

2.5 缺紫草陰性樣品對(duì)照液干擾試驗(yàn)

取缺紫草陰性樣品5g，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下同法操作在UV-2501紫外分光光度計(jì)上于800～400nm波長(zhǎng)處掃描，缺紫草陰性對(duì)照液在516nm處基本無(wú)吸收，且吸收度值極低，可忽略不計(jì)。

2.6 線性關(guān)系的考察

精密吸取對(duì)照品溶液1.4、2.8、4.2、5.6、7.0、8.4mL置25mL量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，以等量的乙醇液為空白對(duì)照，于516nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。以濃度為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)線性回歸，得回歸方程：y=23.157x+0.0017，r=0.9999，左旋紫草素在5.64～33.87μg/mL范圍內(nèi)A與C呈良好線性關(guān)系。見(jiàn)圖4 。

圖4 左旋紫草素對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.7 樣品含量測(cè)定

稱取各樣品5g，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下同法操作，測(cè)定各樣品中左旋紫草素含量。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱取四季青軟膏2.5g、左旋紫草素對(duì)照品4.03mg置小燒杯中，加硅藻土2.5g，攪勻后移至具塞錐形瓶中，加100mL乙醇，于50℃水浴中加熱 ，超聲40min，放冷，靜置，濾過(guò)，取續(xù)濾液5mL加乙醇定容至25mL量瓶中，測(cè)定吸收度，同法操作6次，計(jì)算其回收率。

3 結(jié)果

3.1 樣品含量測(cè)定

3批樣品的紫草素含量分別為0.0169mg/mL（20121105），0.0167mg/mL（20121106），0.0162mg/mL（20121112）。見(jiàn)表1。

3.2 加樣回收率試驗(yàn)

平均回收率為98.8092%，RSD（%）=0.8849。見(jiàn)表2。

3.3 精密度試驗(yàn)

取同一對(duì)照品溶液同法測(cè)定6次，結(jié)果RSD（%）=0.13%（n=6），表明儀器精密度良好。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同批（20121112）復(fù)方四季青油膏樣品6份各5g，分別按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下同法操作，測(cè)定各樣品吸光度，計(jì)算其左旋紫草素含量，測(cè)定結(jié)果RSD（%）=2.2%（n=6），說(shuō)明重復(fù)性良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，UV-2501型-紫外分光光度計(jì)上測(cè)定其吸光度，測(cè)得值RSD（%）=1.4%（n=6），表明供試品溶液在3h內(nèi)基本穩(wěn)定。

4 討論

4.1 復(fù)方四季青軟膏的提取方法

采用油煎法，在提取方法的研究中發(fā)現(xiàn)，若采用傳統(tǒng)的一次提取法[12]，紫草的含量很低，而采用新的提取方法兩次提取法（第一次單獨(dú)用黃凡士林提取紫草，第二次將第一次留下的紫草殘?jiān)c其余藥材再用黃凡士林提取一次），既不造成藥材浪費(fèi)，而且紫草含量大大提升，可高出一次提取法的兩倍[13]。在復(fù)方四季青青軟膏提取中還發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地與不同批次的紫草，含量差異較大， 無(wú)論是藥材的剪碎還是在油煎的過(guò)程中，都對(duì)結(jié)果有著一定的影響。在整個(gè)試驗(yàn)中均需要用同一產(chǎn)地同一批次的紫草，以提高結(jié)果準(zhǔn)確度。

表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果

批號(hào) 吸光度值 吸光度平均值 樣品百分含量（%）

20121105 0.393 0.401 0.388 0.394 0.16

20121106 0.387 0.384 0.393 0.388 0.16

20121112 0.381 0.372 0.381 0.378 0.16

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

樣品號(hào) 樣品含量 加入量 測(cè)得量 回收率（%） 平均回收率（%） RSD（%）

1 4.5149 4.03 8.4700 98.2675

2 4.5150 4.03 8.4780 98.2676

3 4.5100 4.03 8.4700 98.2600 98.8092 0.8849

4 4.5120 4.03 8.4900 98.7651

5 4.5100 4.03 8.4950 98.7690

6 4.5130 4.03 8.5670 100.5025

4.2 供試品的處理方法

采用醇提法。因紫草主含萘醌色素類物質(zhì)，難溶于水，易溶于乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑?？紤]到生產(chǎn)成本與實(shí)際生產(chǎn)情況，選擇乙醇作為溶劑對(duì)復(fù)方四季青軟膏進(jìn)行處理。對(duì)于乙醇濃度及乙醇用量的選擇，因2010年版《中國(guó)藥典》一部中已明確指出用95%的乙醇提取進(jìn)行藥材含量測(cè)定，說(shuō)明其羥基萘醌總色素在95%的乙醇中溶解最好，故本實(shí)驗(yàn)選用的是95%的乙醇對(duì)供試品進(jìn)行處理。而乙醇的用量，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，100mL乙醇可以充分溶解5g樣品。本實(shí)驗(yàn)采用的是100mL 95%的乙醇來(lái)處理供試品。樣品測(cè)定結(jié)果表明， 通過(guò)對(duì)樣品顏色的觀察發(fā)現(xiàn)，左旋紫草素含量高的成品顏色深紅， 而所測(cè)含量較低的成品顏色淺紫， 這可能與紫草原藥材的質(zhì)量有關(guān)。endprint

4.3 測(cè)定方法的選擇

據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道紫草含量測(cè)定可采用高效液相色譜法、薄層掃描測(cè)定法及紫外-可見(jiàn)分光光度法。本試驗(yàn)采用的是紫外分光光度法來(lái)測(cè)定紫草的含量，結(jié)果試驗(yàn)的重現(xiàn)性及回收率均較好。

5 結(jié)論

經(jīng)供試品提取方法試驗(yàn)考查， 用100mL 95%乙醇，超聲提取40min， 供試液穩(wěn)定， 試驗(yàn)的重現(xiàn)性及回收率均較好，且該方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，可用于復(fù)方四季青軟膏中紫草含量的控制。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2014-06-26）endprint

4.3 測(cè)定方法的選擇

據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道紫草含量測(cè)定可采用高效液相色譜法、薄層掃描測(cè)定法及紫外-可見(jiàn)分光光度法。本試驗(yàn)采用的是紫外分光光度法來(lái)測(cè)定紫草的含量，結(jié)果試驗(yàn)的重現(xiàn)性及回收率均較好。

5 結(jié)論

經(jīng)供試品提取方法試驗(yàn)考查， 用100mL 95%乙醇，超聲提取40min， 供試液穩(wěn)定， 試驗(yàn)的重現(xiàn)性及回收率均較好，且該方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，可用于復(fù)方四季青軟膏中紫草含量的控制。

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4.3 測(cè)定方法的選擇

據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道紫草含量測(cè)定可采用高效液相色譜法、薄層掃描測(cè)定法及紫外-可見(jiàn)分光光度法。本試驗(yàn)采用的是紫外分光光度法來(lái)測(cè)定紫草的含量，結(jié)果試驗(yàn)的重現(xiàn)性及回收率均較好。

5 結(jié)論

經(jīng)供試品提取方法試驗(yàn)考查， 用100mL 95%乙醇，超聲提取40min， 供試液穩(wěn)定， 試驗(yàn)的重現(xiàn)性及回收率均較好，且該方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，可用于復(fù)方四季青軟膏中紫草含量的控制。

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