張玲 樊華

【摘 要】目的：研究普羅布考對(duì)環(huán)磷酰胺肝損傷大鼠肝功能的保護(hù)作用和其氧化應(yīng)激的機(jī)制。方法：測(cè)定普羅布考在不同濃度下對(duì)環(huán)磷酰胺作用下細(xì)胞的增殖活性的影響。將50只大鼠隨機(jī)分為5組，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組，普羅布考低、中、高環(huán)磷酰胺，每天一次，持續(xù)5天，制備環(huán)磷酰胺肝損傷模型，10天后檢測(cè)大鼠血清ALT、AST及肝組織各氧化指標(biāo)，同時(shí)取肝組織標(biāo)本觀察病理學(xué)改變。結(jié)果：用普羅布考孵育能夠明顯提高環(huán)磷酰胺作用下HL7702細(xì)胞存活率；與模型對(duì)照組相比，普羅布考組血清ALT、AST明顯下降（P<0.05），肝組織中NO含量、NOS、GSH和SOD活性明顯上升、MDA含量明顯下降（P<0.05），肝組織病理?yè)p傷減輕。結(jié)論：普羅布考能降低環(huán)磷酰胺所致大鼠腎臟損傷具有保護(hù)作用，起保護(hù)作用可能與提高抗氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】普羅布考；環(huán)磷酰胺；肝損傷；氧化應(yīng)激

【中圖分類號(hào)】R965.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004-7484（2014）06-3492-02

Protective Effect and Mechanism of Probucol in the Hepatic Injury of

Cyclophosphamide-induced rats

【Abstract】Aim To observe the effect of different dosages of probucol on the oxidative stress in the hepatic injury of cyclophosphamide-induced rats. Methods：The hepatic injury models were established by ip injection of cyclophosphamide.All the rats were randomly divided into following groups： normal control rats ，model control，different dosages of Probucol treated hepatic injury rats. After 10 days， ALT、ASTwere detected and the liver tissue was acquired for measuring MDA、SOD、GSH-Px、NO and NOS. Result：Compared with model group， ALT、AST and renal concentration of MDA of probucol 800mg·kg-1 group decreased significantly（P<0.05）， while the activity of SOD、NO、NOS and GSH-Px increased significantly （P<0.05） .Histopathology of mice showed probucol can improve hepatic injury. Conclusion：Probucol can inhibit the oxidative stress in the hepatic injury of cyclophosphamide-induced rats

【Key words】hepatic injury； oxidative stress； probucol

環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CP）是人工合成的氮芥類烷化藥，是臨床上常用的廣譜抗腫瘤藥。大量報(bào)道顯示，環(huán)磷酰胺可致肝損傷，主要表現(xiàn)為血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高，膽汁分泌異常，出現(xiàn)黃疸等[1]，影響腫瘤患者治療，氧化應(yīng)激在環(huán)磷酰胺誘發(fā)的化療性肝損傷中發(fā)揮著重要作用[2]，因此從抗氧化應(yīng)激角度尋求一種高效低毒的抗氧化制劑為臨床防治環(huán)磷酰胺引起的肝損傷提供新的方法。近年來(lái)研究顯示普羅布考可以提高機(jī)體抗氧化能力[3-4]，對(duì)機(jī)體有顯著的保護(hù)作用，但普羅布考對(duì)肝損傷的保護(hù)作用研究較少，因此，本研究觀察肝損傷大鼠氧化應(yīng)激水平并采用普羅布考進(jìn)行干預(yù)，探討普羅布考對(duì)肝損傷大鼠腎臟氧化應(yīng)激水平的影響及其保護(hù)作用，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用普羅布考進(jìn)行輔助治療肝損傷提供可能的實(shí)驗(yàn)依據(jù)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1儀器與試藥

主要試劑：環(huán)磷酰胺（上海中西醫(yī)藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)970904），四甲基偶氮噻唑藍(lán)（MTT）（美國(guó)Sigma公司）；胎牛血清、1640培養(yǎng)基和胰酶（美國(guó)GIBCO公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），丙二醛（malondialdehyde，MDA），谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒，一氧化氮（nitricoxide，NO），一氧化氮合酶（nitricoxidesynthase，NOS）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，普羅布考（河北承德頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)971103）。

1.2 動(dòng)物：雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重200～240 g，SPF級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)：HL7702細(xì)胞，購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)；培養(yǎng)基為含雙抗及10%新生牛血清的RPMI-1640，于37℃，5% CO2，的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 普羅布考對(duì)環(huán)磷酰胺致HL7702細(xì)胞的保護(hù)作用[5-6]

將HL7702細(xì)胞接種于96孔板中，每孔5×103個(gè)，培養(yǎng)24h后向各孔中分別加入CP（濃度為4μg/ml），CP+ 普羅布考（濃度依次為200、500、1000μM），每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，孵育48h后MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖率

1.5 細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH蛋白含量的測(cè)定

將HL7702細(xì)胞3 mL接種到6孔板中，24 h后，分別加入CP（濃度為4μg/ml），CP+ 普羅布考500μM，48 h后，消化細(xì)胞并收集，PBS洗2遍，離心棄上清液，PBS清洗，反復(fù)凍融3次，3000 r/min離心15 min，取上清液為細(xì)胞勻漿，測(cè)定MDA、GSH蛋白含量。

1.6 動(dòng)物分組及處理

將60只SD鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、治療組（普羅布考800、400、200mg·kg-1劑量組）每組12只。除空白對(duì)照組外，其余各組腹腔注射100 mg·kg-1環(huán)磷酰胺，每天一次，持續(xù)5天，制備環(huán)磷酰胺肝損傷模型，對(duì)照組給予等量生理鹽水，治療組在最后一次注射CTX后給予普羅布考（800、400和200 mg·kg-1），對(duì)照組和模型組給予相應(yīng)體積的生理鹽水，連續(xù)給藥10天，末次給藥24h后將大鼠麻醉后在無(wú)菌條件下打開腹腔，腹主動(dòng)脈取血，制備血清待檢。取出腎臟，一部分腎組織用4℃生理鹽水沖洗后，稱重研磨制成勻漿，再離心，取上清液測(cè)定MDA水平、SOD和GSH-Px的活性、NO含量和NOS活性。另一部分腎組織光鏡下檢測(cè)組織形態(tài)學(xué)變化[7]。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 普羅布考對(duì)環(huán)磷酰胺致HL7702細(xì)胞體外增殖活性的作用

由圖1可知，在本實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)普羅布考濃度在1000和500μM時(shí)對(duì)環(huán)磷酰胺造成細(xì)胞損傷有顯著保護(hù)的作用，當(dāng)普羅布考濃度達(dá)到1000μM時(shí)，細(xì)胞保護(hù)作用下降。

圖1 普羅布考對(duì)環(huán)磷酰胺致HL7702細(xì)胞體外增殖活性的作用

2.2 普羅布考對(duì)環(huán)磷酰胺致HL7702細(xì)胞MDA、GSH的影響

由表1 可知，在本實(shí)驗(yàn)條件下，與對(duì)照組相比，CP能夠刺激細(xì)胞MDA含量顯著升高（P<0.05），GSH含量顯著降低（P<0.05），而經(jīng)普羅布考干預(yù)后可以顯著降低MDA含量（P<0.05），提高GSH含量（P<0.05）。

2.6 普羅布考對(duì)肝損傷大鼠肝組織病理學(xué)的影響

在光鏡下檢查證實(shí)，正常對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰、形態(tài)正常，無(wú)異常病理表現(xiàn)。模型對(duì)照組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)產(chǎn)生一定的變化，主要表現(xiàn)為肝灶性壞死，肝細(xì)胞壞死，壞死灶內(nèi)及其周圍炎性浸潤(rùn)，經(jīng)普羅布考干預(yù)后，800mg/kg組病理變化減輕，表現(xiàn)為輕度炎性浸潤(rùn)。（圖2）

圖2 普羅布考對(duì)糖尿病大鼠腎組織的作用. A： 空白對(duì)照組，腎組織結(jié)構(gòu)正常；B：模型對(duì)照組，肝灶性壞死，肝細(xì)胞壞死，壞死灶內(nèi)及其周圍炎性浸潤(rùn)；C：普羅布考偶見微小病灶內(nèi)巨噬細(xì)胞聚集和少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；D：普羅布考200mg·kg-1組，肝細(xì)胞空泡變性，胞漿內(nèi)可見大小不一的空泡出現(xiàn)

3 討論

肝臟是藥物主要的代謝器官，也常常成為藥物毒副作用的靶器官。環(huán)磷酰胺經(jīng)肝細(xì)胞色素CYP450 酶系代謝，形成具有烷化作用的磷酰胺氮芥以及具有毒副作用的丙烯醛，另一方面通過(guò)側(cè)鏈氧化生成具有毒副作用的氯乙醛。研究表明代謝產(chǎn)物丙烯醛、4-羥化物和氯乙醛與肝毒性有密切關(guān)系，丙烯醛、4-羥化物和氯乙醛具有很強(qiáng)的親電子能力，易導(dǎo)致機(jī)體抗氧化防御體系的抗氧化能力下降，機(jī)體氧化/抗氧化平衡體系嚴(yán)重失衡，大量自由基形成，自由基化學(xué)性質(zhì)非?；顫?，極易與細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分，如膜磷脂、蛋白質(zhì)、核酸等發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞重要功能酶活性改變，細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境穩(wěn)態(tài)破壞，最終造成氧化應(yīng)激性肝損傷[8-10]。血清酶學(xué)檢查ALT 、AST可以反映肝實(shí)質(zhì)損害及病變的活動(dòng)性，本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)磷酰胺制備肝損傷大鼠模型，其ALT 、AST顯著升高，給予普羅布考干預(yù)后，ALT、AST顯著下降，提示普羅布考對(duì)DN有一定得保護(hù)作用。

在本研究中，我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HL7702細(xì)胞在環(huán)磷酰胺刺激下培養(yǎng)上清中MDA含量增加，，而MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，通過(guò)MDA含量可以反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度，SOD、GSH是機(jī)體主要的抗氧化酶，SOD和GSH水平，是反映機(jī)體抗氧化能力的重要標(biāo)準(zhǔn)[11-13]。適當(dāng)劑量的普羅布考可明顯降低環(huán)磷酰胺刺激下細(xì)胞MDA升高和GSH降低，提示適當(dāng)劑量的普羅布考對(duì)環(huán)磷酰胺造成的細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用，且與提高抗氧化應(yīng)激能力有一定關(guān)系。本研究在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了普羅布考的抗氧化應(yīng)激能力。

NO、NOS也是機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)，肝損傷模型大鼠NO含量降低，NOS活性降低，顯示環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠肝細(xì)胞和NOS活性有損傷作用，經(jīng)過(guò)普羅布考干預(yù)后，NOS活性增加，NO含量升高，進(jìn)一步顯示了環(huán)磷酰胺對(duì)肝臟氧化損傷的保護(hù)作用。

腎臟病理組織學(xué)檢查同樣證實(shí)給予普羅布考后，會(huì)明顯改善環(huán)磷酰胺引起的肝臟病理變化。肝臟病理形態(tài)及肝功能明顯改善，組中腎臟氧化指標(biāo)則也出現(xiàn)部分緩解和減輕，進(jìn)一步說(shuō)明羅格列酮對(duì)腎臟的保護(hù)作用存在劑量關(guān)系。

本研究通過(guò)體外研究探索，體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，普羅布考對(duì)肝損傷會(huì)產(chǎn)生直接的保護(hù)作用，且存在一定的劑量關(guān)系，其保護(hù)機(jī)制可能與降低腎臟組織MDA含量，顯著增加GSH含量和SOD活性，提升NO含量和NOS活性有關(guān)，從而提高機(jī)體組織抗氧化能力，對(duì)于目前臨床上藥物性肝損傷的治療提供了參考依據(jù)。

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