黃東鳳，黃介飛，黃曉平，魏 群，李 峰，張 弘

南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 南通 226001

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見(jiàn)的惡性程度較高的腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第5位，死因居第3位[1]。肝癌是由病毒、化學(xué)致癌物等多病因作用，其發(fā)生、發(fā)展與多種生長(zhǎng)因子等密切相關(guān)。肝硬化(liver cirrhosis，LC)，尤其是乙型肝炎后肝硬化是肝癌發(fā)生的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素[2]。肝硬化和肝癌的發(fā)生、發(fā)展涉及眾多基因改變和分子事件。我們?cè)没蛐酒Y選出肝硬化和肝癌相關(guān)基因[3-5]，其中TRA1在基因水平呈上調(diào)表達(dá)，為了進(jìn)一步了解和驗(yàn)證TRA1基因在肝硬化和肝癌的發(fā)生、發(fā)展的作用，我們采用RT-PCR法對(duì)其在肝癌組織、癌旁肝硬化組織和正常對(duì)照組織的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2006年3月－2006年11月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除組織或活檢組織標(biāo)本共34例。取得肝癌的肝組織20例(其中高分化肝癌6例、中分化肝癌11例、低分化肝癌3例)，遠(yuǎn)癌的肝硬化組織11例(定義:距腫瘤邊緣≥4 cm的肝組織)，非肝癌的肝硬化患者活檢組織8例，肝血管瘤4例，肝內(nèi)膽管結(jié)石2例，男21例，女13例。切下的組織立即置液氮速凍后，于－80℃保存?zhèn)溆?。所有病例均根?jù)病理學(xué)進(jìn)行分類。

1.2 RT-PCR檢測(cè)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成:我們根據(jù)基因芯片技術(shù)篩選肝硬化及肝癌相關(guān)基因差異性表達(dá)的芯片結(jié)果，在肝硬化和肝細(xì)胞癌共同表達(dá)差異基因中，挑選上調(diào)基因中TRA1作為驗(yàn)證基因。從GenBank查取基因序列，TRA1及 β-actin基因編號(hào)分別為 NM_003299、5016088，以Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)TRA1及β-actin的引物各一對(duì)，再經(jīng)GenBank BLAST進(jìn)行同源性檢測(cè)，其序列如下:

TRA15'-TGACCCAAGAGGAAACACTA-3'，5'-CTGCTCCATACATAAATAGG-3';β-actin 5'-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3'，5'-ATGCTATCACCTCCCCTGTG-3'。擴(kuò)增片段大小分別為149 bp、485 bp。

1.3 肝組織中總RNA樣品的提取及分析(TRIZOL法) 從－80℃冰箱中取出肝細(xì)胞癌組織和正常肝組織，解凍后每例組織稱取50～100 mg置入勻漿器，加入1 ml TRIZOL，充分勻漿后倒入1.5 ml離心管，以下步驟按操作說(shuō)明書操作。提取后加入適量DEPC水溶解，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩NA樣本經(jīng)這樣定量及電泳分析后，得到合格的可用于檢測(cè)的RNA。

1.4 cDNA的合成 (1)在冰浴中按順序加入以下試劑后，輕輕混勻 3 ～5 s，再短暫離心:總 RNA 1 μl，Oligo(DT)18 primer 1 μl，0.1%DEPC 水加至 12 μl。(2)置于擴(kuò)增儀上70℃加熱5 min，立即將離心管插入冰浴中3 min。(3)在冰浴中，按順序加入以下試劑后再輕輕混勻，短暫離心:

5 × RT Buffer 4 μl

Ribolock Ribonudease inhibitor 1 μl

10 mM dNTPmix 2 μl

Revert Aid M-Mulu Reversre Transcriptase 1 μl

總體積 20 μl

42℃水浴60 min;置于擴(kuò)增儀上70℃加熱10 min，終止反應(yīng)。所得產(chǎn)物可用于PCR擴(kuò)增。(4)RTPCR擴(kuò)增:在0.5 ml離心管中按順序加入10×PCR Buffer、MgCl2各 5 μl，dNTP(10 μ/μl)、cDNA、Taq 酶(1 μ/μl)、上游引物、下游引物各1 μl，0.1%DEPC 水35 μl，置于PCR擴(kuò)增儀上擴(kuò)增。反應(yīng)條件為預(yù)變性92℃ 2 min，變性92℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，循環(huán)30次，最后72℃延伸5 min，得到最終產(chǎn)物。取10 μl PCR產(chǎn)物及上樣緩沖液(0.25 g溴酚藍(lán)、30%甘油水溶液100 ml)1 μl，混勻后短暫離心，小心加入1 μl。5%瓊脂糖凝膠中，以120 V電壓電泳約30 min后，于320 nm紫外透射儀下觀察電泳結(jié)果。用捷達(dá)801分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，以各樣本目的基因平均A值/β-actin平均A值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Stata 7.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理分析，率的比較采用 Fisher’s確切概率法，TRA1 mRNA表達(dá)的相對(duì)定量采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

我們利用RT-PCR檢測(cè)芯片結(jié)果中部分基因mRNA的表達(dá)情況，將TRA1及內(nèi)參β-actin的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，其條帶與100 bp DNA Ladder相比較，引物有較好的特異性，其分子量大小與預(yù)先設(shè)計(jì)相一致(見(jiàn)圖1)。TRA1基因在肝癌與對(duì)照組間表達(dá)陽(yáng)性率分別為95.00%、50.00%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);肝硬化與對(duì)照組間表達(dá)陽(yáng)性率分別為84.21%、50.00%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05，見(jiàn)表1)。但經(jīng)半定量分析，在肝癌及肝硬化與對(duì)照組間，擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)出表達(dá)量的不同，分別為 1.67 ±0.96、1.49 ±0.53、0.57±0.27，肝癌及肝硬化與對(duì)照組間表達(dá)有一定的漸變趨勢(shì)，TRA1基因的mRNA表達(dá)光密度水平在肝癌及肝硬化與對(duì)照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)，肝癌與肝硬化間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見(jiàn)表2、圖2)。

表1 TRA1 mRNA在相應(yīng)組織中表達(dá)陽(yáng)性率Tab1 Positive rate of TRA1 mRNA in the corresponding tissues

表2 TRA1 mRNA在相應(yīng)組織表達(dá)的光密度值半定量分析Tab2 Semi-quantitative analysis of TRA1 mRNA optical density value in the corresponding expression

圖1 基因表達(dá)mRNA產(chǎn)物電泳圖Fig1 Electrophoresis of mRNA gene expression product

圖2 TRA1 mRNA在各組中表達(dá)Fig2 Expression of TRA1 mRNA in each group

3 討論

熱休克蛋白(HSPs)又稱應(yīng)激蛋白(SP)，是一類在生物進(jìn)化過(guò)程中極為保守的蛋白質(zhì)，在應(yīng)激狀態(tài)下可被誘導(dǎo)表達(dá)，因此具有提高細(xì)胞應(yīng)激的耐受性及維護(hù)細(xì)胞自穩(wěn)等重要生物功能[6]。HSPs家族是一類極為保守的蛋白質(zhì)，當(dāng)機(jī)體受到有害因素(如炎癥、紫外線、應(yīng)急、腫瘤發(fā)生等)刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi) HSPs合成增加，它能保護(hù)機(jī)體(或細(xì)胞)不受或少受傷害[7]。TRA1(gp96)是HSP90家族的成員，它通過(guò)轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控等多種途徑參與細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖[8-9]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多種因素的多種步驟發(fā)展而來(lái)，涉及到多種基因突變的積累，也是一個(gè)量變到質(zhì)變的過(guò)程。腫瘤細(xì)胞自身與機(jī)體不相協(xié)調(diào)的增生和惡性特征在一定程度上與gp96的表達(dá)密切相關(guān)，gp96在腫瘤免疫中充當(dāng)了多重角色[10]，一方面作為“分子伴侶”參與腫瘤細(xì)胞的功能代謝，保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受損害[11];另一方面由于腫瘤細(xì)胞與機(jī)體正常細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、分化的異質(zhì)性，使gp96成為與其相結(jié)合的腫瘤抗原多肽的靶載體，在參與腫瘤抗原的免疫反應(yīng)中充當(dāng)了舉足輕重的角色[12]。它的高表達(dá)有助于某些腫瘤的形成[13]。gp96在生殖及胚胎細(xì)胞中表達(dá)較強(qiáng)，而在衰老細(xì)胞中表達(dá)較弱，提示增殖活躍的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)，需要較多gp96參與蛋白質(zhì)活性功能的形成。而腫瘤是增殖旺盛的異型細(xì)胞，可能需要較多gp96來(lái)維持其不斷增殖[14]。隨著腫瘤病變的演進(jìn)和惡性程度的提高，腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)不斷增高，凋亡細(xì)胞比例逐漸下降，細(xì)胞積聚速度明顯加快，使腫瘤生長(zhǎng)加快，并表現(xiàn)出惡性行為[15]。

學(xué)者M(jìn)eng等[16]首次從HBV感染的患者肝癌組織中分離純化出與熱休克蛋白gp96結(jié)合的HBV特異肽。國(guó)內(nèi)外研究表明正常情況下gp96多存在于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中并且表達(dá)量非常低。在慢性乙型肝炎肝組織中g(shù)p96的檢出率比正常肝組織顯著升高，提示gp96的陽(yáng)性細(xì)胞率與炎癥程度有關(guān)。Fu等[17]認(rèn)為，gp96的高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。在乳腺癌、腎癌、黑色素瘤、肺癌、食管癌、胃癌、肝癌和結(jié)腸癌等組織中都發(fā)現(xiàn)gp96有不同程度的高表達(dá)。Singh-Jasuja等[18]認(rèn)為gp96的表達(dá)能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)。gp96自體腫瘤疫苗對(duì)結(jié)腸癌的治療作用已經(jīng)進(jìn)入了臨床Ⅰ/Ⅱ期評(píng)價(jià)[19]。

肝硬化與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，每年約有2% ～6%的肝硬化患者進(jìn)展為肝癌，肝硬化及肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中需要gp96作為分子伴侶來(lái)調(diào)節(jié)、穩(wěn)定這一過(guò)程。Radosevic-Stasic等[20]研究顯示在肝部分切除小鼠，gp96水平隨肝細(xì)胞再生而升高。在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，由于腫瘤組織生長(zhǎng)快，局部缺血、缺氧及酸中毒，這些應(yīng)激條件誘使腫瘤組織產(chǎn)生熱休克蛋白，從而保護(hù)腫瘤細(xì)胞戰(zhàn)勝機(jī)體內(nèi)各種不利的生理環(huán)境。同時(shí)，作為一種抗凋亡蛋白。本研究中，gp96的陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度在對(duì)照組、肝硬化組和肝癌組逐漸增高，推測(cè)其可能參與了肝硬化的發(fā)生、發(fā)展及向肝癌的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程，肝癌中g(shù)p96的過(guò)度表達(dá)除了有促進(jìn)肝癌的增殖的作用外，還促進(jìn)肝炎后肝細(xì)胞再生形成肝硬化結(jié)節(jié)，并致使其惡性化，同時(shí)對(duì)肝癌細(xì)胞有保護(hù)作用，另外gp96過(guò)度表達(dá)可通過(guò)下調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因、蛋白和蛋白酶活性而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力，使細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)和死亡效應(yīng)減弱，進(jìn)一步加重肝硬化及向肝癌轉(zhuǎn)變，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、惡性程度、轉(zhuǎn)移、分化和預(yù)后有密切關(guān)系，因而在肝硬化和肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。gp96在肝硬化向肝癌發(fā)生發(fā)展中如何發(fā)揮作用，有待進(jìn)一步研究。本研究為進(jìn)一步探究肝硬化、肝癌的分子機(jī)制提供了線索，TRA1可能是診斷肝硬化及肝癌的潛在生物標(biāo)記、治療的潛在靶點(diǎn)。

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