殷積彬，張文華，高善玲，潘麗麗，劉 超，劉冰熔，胡麗紅，褚艷杰

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150086;2.河北省滄州市人民醫(yī)院消化內(nèi)科;3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院研究生科

近年來隨著大量研究的深入，肝硬化患者胃腸動(dòng)力異常的表現(xiàn)及其發(fā)生機(jī)制方面有了一定的進(jìn)展，但機(jī)制尚不明確。國(guó)內(nèi)外許多研究均證實(shí)，肝硬化時(shí)胃動(dòng)素明顯升高，且隨肝功能損害加重(按Child分級(jí))逐漸升高，但對(duì)于胃動(dòng)素受體的研究卻很少。本實(shí)驗(yàn)通過建立肝硬化大鼠模型，測(cè)定其胃腸運(yùn)動(dòng)情況及十二指腸收縮力，測(cè)定胃動(dòng)素受體的表達(dá)，進(jìn)一步研究肝硬化胃腸運(yùn)動(dòng)障礙的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物:健康雄性 Wistar大鼠55只，體質(zhì)量為150～200 g，6～8周齡，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 藥品和試劑:四氯化碳(分析純)天津天力化學(xué)試劑有限公司;橄欖油(化學(xué)純)上海凌風(fēng)試劑有限公司;Kreb液(氯化鈉 118.5 mmol/L，碳酸氫鈉 25 mmol/L，磷酸二氫鉀 1.2 mmol/L，氯化鉀 4.8 mmol/L，七水和硫酸鎂1.2 mmol/L，葡萄糖11 mmol/L，氯化鈣2.4 mmol/L，37 ℃，pH=7.4);兔抗人胃動(dòng)素受體抗體購(gòu)自Abgent試劑公司;非生物素化山羊抗兔IgG抗體和DAB酶底物顯色試劑盒購(gòu)自中杉金橋試劑公司。

1.1.3 儀器:多通道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(RM6240C型，成都儀器廠);橫紋平滑肌槽(HW-400SE，成都泰盟科技有限公司);肌肉張力換能器(JZJ01型，成都儀器廠);分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立動(dòng)物模型:大鼠于室溫環(huán)境下正常飼養(yǎng)3 d以適應(yīng)環(huán)境。其中10只大鼠使用營(yíng)養(yǎng)均衡的正常飼料喂養(yǎng)作為正常對(duì)照組。45只給予40%四氯化碳－橄欖油溶劑[1]雙下肢皮下注射0.3 ml/100 g，每周2次，共24次(如果大鼠體質(zhì)量下降≥5 g則停止給藥一次，待體質(zhì)量增加后繼續(xù)給藥至24次)，至全部大鼠給藥均達(dá)24次后造模結(jié)束。

1.2.2 消化道鋼珠排出實(shí)驗(yàn):肝硬化組與正常組大鼠于非麻醉狀態(tài)下分別將混有6顆鋼珠(鋼珠直徑為1 mm，于放射線下顯影)的2 ml生理鹽水注入胃腔，于X線下確定鋼珠處于大鼠胃腔內(nèi)。受檢動(dòng)物灌入試劑后，分別于第12小時(shí)、第24小時(shí)、第48小時(shí)于放射線下觀察大鼠體內(nèi)鋼珠的位置及排出情況。

1.2.3 十二指腸肌力的檢測(cè):肝硬化組與正常組大鼠禁食不禁水12 h，頸椎脫臼處死后立即剖腹暴露全胃腸道，自大鼠胃竇下取長(zhǎng)約1.5 cm十二指腸環(huán)形肌條。肌條經(jīng)Kreb液充分沖洗后，豎直懸掛于充滿Kreb液的浴槽中(通空氣，37℃，pH=7.4)，給予初始張力2 g，平衡后開始實(shí)驗(yàn)。采用多通道生理藥理分析系統(tǒng)記錄張力的變化。

1.2.4 免疫組化過程:DAB顯色，PBS代替第一抗體作為陰性對(duì)照，蘇木精－伊紅染色及免疫組化操作步驟參照說明書，一抗滴度1∶10。

1.2.5 免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn):采用二級(jí)計(jì)分法，首先按染色強(qiáng)度評(píng)分，無色為0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分;然后按細(xì)胞陽性率評(píng)分，采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)，選取同一染色條件下的免疫組化片，分析得到陽性表達(dá)密度。細(xì)胞無陽性細(xì)胞為0分，陽性率≤10%為1分，11% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分，兩者相加為綜合評(píng)分。0分為－;1～4分為+;5～7分為++;＞7分為+++。

1.2.6 模型判定:大鼠脊椎脫臼處死后，立即開腹取部分肝臟組織，HE染色，光鏡下觀察肝臟結(jié)構(gòu)是否有廣泛的纖維化及假小葉形成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)測(cè)定采用χ2檢驗(yàn)的Fisher確切概率檢驗(yàn)法;十二指腸肌條收縮力采用T檢驗(yàn)，差異性比較采用F分析;胃動(dòng)素受體測(cè)定等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝臟變化 正常對(duì)照組大鼠肝臟表面光滑，光鏡下顯示大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索由中央靜脈向四周放射狀排列;第12周大鼠肝臟色澤灰白，表面明顯凹凸不平，出現(xiàn)大小不等結(jié)節(jié)，大量膠原纖維交織成網(wǎng)，肝細(xì)胞排列紊亂，典型假小葉廣泛形成。造模結(jié)束后，模型組大鼠共死亡25只，死亡率為55.6%。

2.2 肝硬化模型組和正常對(duì)照組大鼠鋼珠排出時(shí)間肝硬化模型組與正常對(duì)照組大鼠分別于灌胃后第12小時(shí)、第24小時(shí)、第48小時(shí)于放射線下觀察大鼠胃腸內(nèi)鋼珠的位置及其排出情況(見圖1～2、表1)。結(jié)果表明:肝硬化模型組大鼠的鋼珠排出速度較正常對(duì)照組大鼠的鋼珠排出速度明顯緩慢，差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)表明:肝硬化模型組大鼠在體胃腸排出功能障礙。

2.3 肝硬化模型組與正常對(duì)照組大鼠十二指腸肌條收縮張力 取大鼠十二指腸肌條采用張力換能器測(cè)量肝硬化模型組及對(duì)照組大鼠離體十二指腸肌條收縮力，使用多通道生理藥理分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄。結(jié)果表明:肝硬化模型組大鼠(0.739±0.158)g比正常對(duì)照組(0.879±0.201)g十二指腸肌條平均收縮張力明顯減弱(見圖3～4)。實(shí)驗(yàn)表明:肝硬化模型組大鼠離體十二指腸收縮功能障礙。

2.4 肝硬化模型組和正常對(duì)照組大鼠十二指腸組織胃動(dòng)素受體的測(cè)定 免疫組化法檢測(cè)大鼠胃動(dòng)素受體表達(dá)強(qiáng)度及分布情況。切片于普通光鏡下觀察顯示胃動(dòng)素受體陽性細(xì)胞染色呈黃棕色，且主要表達(dá)于腺上皮細(xì)胞，黏膜上皮細(xì)胞中幾乎無表達(dá)。肝硬化模型組大鼠胃動(dòng)素受體表達(dá)與正常對(duì)照組大鼠相比較，染色淺、分布較少(見圖5～6、表2)。結(jié)果表明:肝硬化模型組大鼠十二指腸組織胃動(dòng)素受體染色淺，分布較少。

表1 肝硬化模型組和正常對(duì)照組大鼠消化道內(nèi)鋼珠排出時(shí)間Tab1 The emptying time of steel ball in the digestive tract in liver cirrhosis group and control group

表2 肝硬化模型組和正常對(duì)照組大鼠十二指腸組織胃動(dòng)素受體表達(dá)Tab2 The expression of Motilin receptor in duodenal in liver cirrhosis group and control group

3 討論

肝硬化患者臨床上常出現(xiàn)惡心、食欲減退、腹脹等胃腸道癥狀，研究表明上述癥狀與胃腸運(yùn)動(dòng)障礙有密切關(guān)系。肝硬化患者伴有胃腸運(yùn)動(dòng)障礙，其中包括食管運(yùn)動(dòng)障礙、胃排空障礙、小腸運(yùn)動(dòng)障礙等方面。實(shí)驗(yàn)[2]證實(shí)肝硬化患者食管下括約肌(LES)松弛持續(xù)時(shí)間較正常人明顯延長(zhǎng);食管蠕動(dòng)壓力幅值變小，食管對(duì)食糜的推動(dòng)力明顯減弱，故其蠕動(dòng)持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)。肝硬化患者胃動(dòng)力減弱，對(duì)固體食物排空減慢，液體排空時(shí)間明顯延長(zhǎng)。國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明肝硬化時(shí)MMCⅡ期顯著延長(zhǎng)，從而使MMC周期延長(zhǎng)，增加食物殘?jiān)谖竷?nèi)的停留時(shí)間，故引起肝硬化患者腹脹、早飽等臨床癥狀。同時(shí)肝硬化患者胃電節(jié)律紊亂[3]，且與肝硬化Child分級(jí)呈正相關(guān)。因胃十二指腸在食物排空能力上是相互聯(lián)系的，其不同部位在收縮的時(shí)間與空間上具有協(xié)調(diào)性，因此當(dāng)胃電節(jié)律破壞時(shí)，整個(gè)消化系統(tǒng)的排空能力都會(huì)受到影響。MMC周期中Ⅲ期以強(qiáng)烈收縮為特點(diǎn)，是小腸運(yùn)動(dòng)的主要?jiǎng)恿Α８斡不瘯r(shí)小腸收縮功能紊亂，Ⅲ期幾乎消失，胃腸功能進(jìn)一步減弱。

圖1 鋼珠位于大鼠上腹部;圖2 鋼珠位于大鼠下腹部;圖3 正常大鼠十二指腸肌條收縮張力;圖4 肝硬化大鼠十二指腸肌條收縮張力;圖5 正常大鼠胃動(dòng)素受體表達(dá)(400×);圖6 肝硬化大鼠胃動(dòng)素受體表達(dá)(400×)Fig1 Steel ball was located in the upper abdomen of rats;Fig2 Steel ball was located in the lower abdomen of rats;Fig3 Tension of contraction of normal rat duodenum muscle strips;Fig4 Tension of contraction of liver cirrhosis rat duodenum muscle strips;Fig5 The expression of Motilin receptor in normal rat(400×);Fig6 The expression of Motilin receptor in liver cirrhosis rat(400×)

本實(shí)驗(yàn)通過大鼠皮下注射四氯化碳橄欖油混合液建立肝硬化模型，從而研究其胃腸運(yùn)動(dòng)障礙與胃動(dòng)素受體的關(guān)系。通過觀察活體正常大鼠與肝硬化大鼠胃腸內(nèi)小鋼珠排空時(shí)間，表明肝硬化大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)減弱，排泄時(shí)間明顯延長(zhǎng)。同時(shí)通過測(cè)定正常大鼠與肝硬化大鼠離體十二指腸肌收縮力證明，肝硬化大鼠十二指腸收縮張力較正常大鼠明顯減弱。證明肝硬化大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙，此結(jié)果與臨床觀察到的肝硬化患者早飽、腹脹等癥狀具有相似性。

然而肝硬化時(shí)胃腸功能障礙的機(jī)制并不十分明確，可能與神經(jīng)體液因素(包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腸神經(jīng)系統(tǒng)[4]等)、炎癥介質(zhì)、腹水形成、內(nèi)毒血癥等相關(guān)。

胃動(dòng)素作為腦－腸肽的一種，存在兩種狀態(tài):胃腸道內(nèi)充滿食物時(shí)，胃動(dòng)素處于飽食狀態(tài);兩餐之間是胃動(dòng)素處于消化間期狀態(tài);其主要于消化道間期呈周期性釋放，發(fā)揮作用，屬于消化間期激素[5]。胃內(nèi)容物、胃擴(kuò)張、迷走神經(jīng)興奮等可刺激胃動(dòng)素釋放增加，靜脈內(nèi)注射氨基酸、生長(zhǎng)抑素則能抑制其釋放。

Feng等[6]證實(shí)大鼠腦杏仁核內(nèi)注入少量胃動(dòng)素受體可促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)。免疫組化法證實(shí)大鼠胃動(dòng)素受體主要分布于神經(jīng)細(xì)胞的胞膜上。胃動(dòng)素平滑肌受體相關(guān)研究已證明，胃竇部胃動(dòng)素受體的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于十二指腸和結(jié)腸[7]。胃動(dòng)素放射自顯影發(fā)現(xiàn)胃動(dòng)素受體存在于海馬、杏仁體、小腦等神經(jīng)系統(tǒng)中[8]。

體外實(shí)驗(yàn)證明，胃動(dòng)素可通過直接作用于平滑肌細(xì)胞的胃動(dòng)素受體而起作用;此外胃動(dòng)素通過作用于腸道神經(jīng)系統(tǒng)中的胃動(dòng)素神經(jīng)元，引起胃強(qiáng)烈收縮和小腸明顯的分節(jié)運(yùn)動(dòng)，增強(qiáng)胃腸道運(yùn)動(dòng)。胃動(dòng)素對(duì)胃動(dòng)素受體的發(fā)揮作用具有劑量依賴性。高劑量的胃動(dòng)素作用于平滑肌胃動(dòng)素受體，通過PLC-IP3途徑，使胞內(nèi)鈣離子釋放，引起短暫的鈣依賴性收縮;通過激活RhoA途徑，引起持久的非鈣依賴性收縮。促進(jìn)乙酰膽堿釋放而啟動(dòng)腸道移行運(yùn)動(dòng)復(fù)合波，進(jìn)而誘發(fā)胃平滑肌收縮;低劑量的胃動(dòng)素作用于神經(jīng)型胃動(dòng)素受體，即肌間神經(jīng)叢胃動(dòng)素受體，使神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高，提高神經(jīng)的興奮性。

肝臟是胃動(dòng)素滅活的主要部位，但是目前對(duì)胃動(dòng)素與疾病的關(guān)系了解尚少，現(xiàn)僅知機(jī)體在某些異常情況下，血漿中胃動(dòng)素濃度可以升高或降低。胃動(dòng)素作為胃腸激素的一種，與胃腸功能障礙性疾病有著密切關(guān)系[9]。肝硬化時(shí)胃腸功能減弱，血漿胃動(dòng)素水平與正常組相比明顯升高，且隨著肝功能損害程度加重[10]。胃動(dòng)素水平升高可能與肝硬化時(shí)肝臟對(duì)胃動(dòng)素的清除能力下降、門體分流及腎功能損害相關(guān)[11]。理論推測(cè)血清中胃動(dòng)素含量升高，胃腸運(yùn)動(dòng)應(yīng)增強(qiáng)，但臨床卻發(fā)現(xiàn)肝硬化時(shí)胃腸運(yùn)動(dòng)障礙，其可能與肝硬化患者胃動(dòng)素受體數(shù)目減少或性質(zhì)改變、敏感性下降有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化法檢測(cè)正常組及肝硬化組大鼠十二指腸組織胃動(dòng)素受體的表達(dá)，證實(shí)肝硬化大鼠胃動(dòng)素受體染色淺、分布較少，表達(dá)減弱。因此，我們可以推測(cè)肝硬化大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)減弱與胃動(dòng)素受體的表達(dá)具有相關(guān)性。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)肝硬化胃腸功能障礙的機(jī)制進(jìn)行了大量研究，取得了顯著進(jìn)展。隨著肝硬化胃腸功能障礙機(jī)制研究的深入，必將使臨床對(duì)肝臟疾病的治療進(jìn)入一個(gè)嶄新的階段。

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