韓波等

【摘要】 目的：研究胃動素對大鼠下丘腦PVN神經(jīng)元細(xì)胞電壓依賴性鉀電流的影響。方法：采用急性分離新生Wistar大鼠下丘腦細(xì)胞和全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)的方法，觀察胃動素對大鼠下丘腦PVN神經(jīng)元細(xì)胞電壓依賴性鉀電流的影響。結(jié)果：胃動素可抑制大鼠下丘腦PVN神經(jīng)元電壓依賴性鉀電流，使電流由（5.406±0.86）nA降至（3.621±0.78）nA，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。步進(jìn)電刺激下丘腦神經(jīng)元，隨著刺激電壓強(qiáng)度的增強(qiáng)，鉀外向電流增加，使電壓-電流曲線（Ⅰ～Ⅴ曲線）右移，但不改變Ⅰ～Ⅴ曲線的形態(tài)。結(jié)論：胃動素可通過抑制大鼠下丘腦PVN神經(jīng)元細(xì)胞電壓依賴性鉀電流，發(fā)揮其增強(qiáng)胃腸運動的作用。

【關(guān)鍵詞】 胃動素； 下丘腦PVN細(xì)胞； 全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)； 電壓依賴性鉀電流

【Abstract】 Objective：To study the influence of motilin on the voltage-dependent K+ current of hypothalamic PVN neurons.Method：Patch clamp experiment：rat hypothalamic PVN neurons cells were acute dissociated and observed the influence of motilin on voltage-dependent K+ current of hypothalamic PVN neurons using whole-cell patch-clamp techniques.Result：Motilin could inhibit the voltage-dependent K+ current of rat hypothalamic PVN neurons.The current was decreased from （5.406±0.86）nA to （3.621±0.78）nA，the difference was statistically significant（P<0.05）.Step electric stimulation of hypothalamic neurons，with stimulus voltage strength increased，outward potassium current increased，and the Ⅰ-Ⅴ curve shifted right，but the form of the Ⅰ-Ⅴ curve was not changed.Conclusion：Motilin can enhance the motility of gastrointestinal through inhibiting the voltage-dependent K+ current of hypothalamic PVN neurons.

【Key words】 Motilin； Hypothalamic PVN neurons； Whole-cell patch clamp； Voltage-dependent K+ current

First-authors address：The Peoples Hospital of Weicheng District in Weifang City，Weifang 261021，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.25.005

眾所周知，下丘腦是一個重要的飲食調(diào)節(jié)中樞。下丘腦位于前腦底部，主要有內(nèi)側(cè)區(qū)和外側(cè)區(qū)組成，其內(nèi)存在一個食欲調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，并受生物節(jié)律的影響[1-3]。下丘腦弓狀核（ARC）、腹內(nèi)側(cè)區(qū)（VMH）、背內(nèi)側(cè)核（DMN）、室旁核（PVN）、視交叉上核（SCN）和外側(cè)區(qū)（LHA）等均是“網(wǎng)絡(luò)中心”的重要組成部分。其中VMH被稱為飽食中樞，電刺激VMH可抑制攝食，而損毀雙側(cè)VMH則導(dǎo)致攝食過量和肥胖[4]?，F(xiàn)在普通認(rèn)為，PVN是中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)胃腸運動的重要中樞。有研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦的弓狀核參與胃動素對胃腸運動的調(diào)節(jié)，另外在腦脊液中注射胃動素相關(guān)肽ghrelin可導(dǎo)致下丘腦PVN、DMN、VMH的c-fos表達(dá)增加，同時孤束核（NTS）c-fos的表達(dá)也有增加，并通過迷走神經(jīng)激活下丘腦促食欲神經(jīng)肽Y介導(dǎo)的生長素受體的激活[5-7]。

胃動素是一種由22種氨基酸組成的腦腸肽，空腹時由小腸上端黏膜合成并呈周期性釋放，具有促進(jìn)胃排空和增強(qiáng)胃腸運動的作用[8]。許多研究證明，大鼠腦內(nèi)存在著胃動素免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元。胃動素在大鼠腦內(nèi)的分布和其他神經(jīng)肽不同，以小腦的胃動素濃度最高。在下丘腦內(nèi)側(cè)基底部和正中隆起具有中等濃度的胃動素分布，提示腦內(nèi)的胃動素能神經(jīng)元可能具有神經(jīng)內(nèi)分泌作用[9]。臨床已有報道稱，靜脈內(nèi)給予胃動素能夠加速胃排空的速率和增強(qiáng)胃癌患者消化間期移行性綜合波三期的運動[10]。多項研究表明，胃動素促進(jìn)胃腸運動主要在PVN通過PVN-延髓（DVC）-迷走神經(jīng)軸實現(xiàn)[11-12]。但是，胃動素怎樣通過影響下丘腦PVN神經(jīng)元細(xì)胞的通道實現(xiàn)調(diào)節(jié)胃腸運動的作用還未有報道。本文運用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察胃動素對下丘腦PVN神經(jīng)元細(xì)胞電壓依賴性鉀電流的作用，來進(jìn)一步探討其調(diào)節(jié)胃腸運動的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 新生1～3 d的Wistar大鼠7只，由濰坊醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。胃動素（Sigma公司）、胰蛋白酶、蛋白酶（protease E）（solarblo公司），HEPES（sigma公司），其余均為國產(chǎn)分析純。人工腦脊液（ACSF）：NaCl 126 mmol/L，KCl 5 mmol/L，CaCl2 2 mmol/L，MgSO4

2 mmol/L，NaHCO3 5 mmol/L，NaH2PO4 1.5 mmol/L，endprint

Glucose 10 mmol/L（現(xiàn)配）。通95%O2+5%CO2混合氧，調(diào)節(jié)pH至7.4。標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液：NaCl 150 mmol/L，KCl 5 mmol/L，CaCl2 2 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，D-Glucose 10 mmol/L，MaCl2 1 mmol/L，NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4。電極內(nèi)液：KCl 140 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，HEPES

10 mmol/L，MaCl2 1 mmol/L，Na2ATP 4 mmol/L，用KOH調(diào)節(jié)pH至7.4。

1.2 細(xì)胞分離 根據(jù)Paxions-Watson圖譜，運用酶解以及機(jī)械法消化大鼠下丘腦PVN神經(jīng)元細(xì)胞。在0～4 ℃的孵育液中孵育后，取出組織，在ACSF中剪成約

1 cm3的組織塊，室溫靜置30 min。在含0.05%胰酶的緩沖液中于32 ℃通氧消化30 min，沖洗兩遍，將組織塊置于含0.05%蛋白酶E的緩沖液中進(jìn)行二次消化。棄去消化液，放置在含2 mL細(xì)胞外液的35 mm的培養(yǎng)皿中，輕輕吹打成細(xì)胞懸液，靜置20 min待細(xì)胞貼壁后，即可進(jìn)行膜片鉗記錄。為了阻斷Ca2+和Na+通道，實驗開始前加入CdCl2（200 ?M）和TTX（1.2 ?M）。

1.3 全細(xì)胞膜片鉗記錄 玻璃微電極由微電極拉制儀（PP-83，Narishige，Japan）分兩步拉制，尖端直徑為1～2 μm，充灌內(nèi)液后電極阻抗為2～4 MΩ。運用EPC9膜片鉗放大器（HEKA，Germany）進(jìn)行全細(xì)胞模式的電壓鉗記錄，當(dāng)電極入液后加負(fù)壓破膜，使電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液相通，形成全細(xì)胞記錄模式，待破膜穩(wěn)定后補(bǔ)償慢電容（Cs）以及局部串聯(lián)電阻（Rs），隨即開始進(jìn)行記錄，刺激頻率為1 KHz，采集頻率為2 KHz。實驗過程中Rs<25 MΩ且電流穩(wěn)定的數(shù)據(jù)被看作有效數(shù)據(jù)。所有實驗均在20～25 ℃室溫下進(jìn)行。

1.4 給藥方法 采用微量注射器快速給藥（胃動素最終濃度為10-6 mol/L），觀察給藥前后下丘腦PVN神經(jīng)元細(xì)胞電壓依賴性鉀電流的變化和電流-電壓曲線（Ⅰ～Ⅴ曲線）的改變。每次給藥實驗結(jié)束后經(jīng)灌流沖洗1 min再行下次加藥觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)結(jié)果分析均在HEKA Pulsefit 8.5和Origin 6.0軟件上完成，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃動素對下丘腦PVN神經(jīng)元細(xì)胞電壓依賴性鉀電流峰值的影響 待急性分離的細(xì)胞貼壁后，使用ACSF灌流沖洗，洗去未貼壁的細(xì)胞，鏡下觀察選取胞膜完整清晰，立體感強(qiáng)的細(xì)胞進(jìn)行操作。在鉗制電壓-80 mV、刺激電壓（Vt）30 mV條件下，記錄給藥前后下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞電壓依賴性鉀電流的改變。結(jié)果顯示，給予胃動素（終濃度10-6 mol/L）2～3 min后，電刺激下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞，鉀外向峰值電流明顯降低，峰值電流由（5.406±0.86）nA降至（3.621±0.78）nA，降低了（24.01±6.39）%（P<0.05），見圖1。

3 討論

當(dāng)攝入食物時，其食物成分刺激消化道的感官細(xì)胞，產(chǎn)生的信號由迷走神經(jīng)，通過一系列的級聯(lián)反應(yīng)，傳入抬到腦干孤束核。然后從孤束核將這內(nèi)臟資訊傳遞到大腦的其他不同部位，發(fā)揮其參與內(nèi)分泌，植物神經(jīng)和行為效應(yīng)的作用。有研究表明，當(dāng)注入下丘腦或入腦室胃動素會增加胃腸蠕動，提示下丘腦是胃動素作用一個主站點[13]，而且是通過PVN-DVC-迷走神經(jīng)軸實現(xiàn)。胃動素在食物的消化中起著重要的作用，它在消化間期呈周期性釋放，并可刺激消化道的機(jī)械和細(xì)胞電運動，并可引起膽汁的分泌[14]。胃動素及其受體分布廣泛，不僅存在于胃腸等外周器官，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)如下丘腦、海馬、丘腦、垂體、松果體等也有廣泛的存在[15]。最近研究發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺癌患者中也發(fā)現(xiàn)了胃動素的表達(dá)，并通過血液運輸影響胃腸運動和PNV的調(diào)節(jié)功能[16]。以前有研究表明，在大鼠的下丘腦室旁核（PVN）內(nèi)給予胃動素和胃動內(nèi)酯后，可加強(qiáng)大鼠的胃運動，還可誘導(dǎo)PNV中立早基因c-fos的表達(dá)，這都表明中樞尤其是下丘腦的胃動素參與了胃腸運動的調(diào)節(jié)[6]。

鉀通道在人體的各種生理活動中起著非常重要的作用，其主要由電壓依賴性、受體偶聯(lián)性、鈣敏感及ATP敏感性鉀通道組成，而電壓依賴性鉀通道是其家族中的重要成員。電壓依賴性鉀通道主要由快速失活A(yù)型通道和毒蕈堿敏感的M通道組成，尤其是快速失活性鉀通道廣泛分布在神經(jīng)元中，主要功能是產(chǎn)生動作電位，它的開啟受細(xì)胞膜電位的控制，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)元的放電及其興奮，發(fā)揮其生理特性。電壓依賴性鉀電流在在受到外來刺激后，可產(chǎn)生外向電流，改變細(xì)胞的靜息膜電位，影響細(xì)胞的基本電節(jié)律及其動作電位。

本研究發(fā)現(xiàn)，胃動素可顯著地抑制大鼠下丘腦PVN神經(jīng)元細(xì)胞的電壓依賴性鉀電流，峰值電流從（5.406±0.86）nA降至（3.621±0.78）nA，Ⅰ-Ⅴ曲線右移，但是形態(tài)無明顯改變。因電壓依賴性鉀電流主要影響動作電位的時程，當(dāng)鉀電流被抑制時，動作電位的時程可延長，而導(dǎo)致鈣電流內(nèi)流增加，進(jìn)而影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。本課題組以前發(fā)現(xiàn)，胃動素受體激動劑紅霉素也可抑制小鼠海馬神經(jīng)元電壓依賴性鉀電流，此次結(jié)果從而驗證了PVN與海馬等調(diào)節(jié)胃腸功能的神經(jīng)中樞有著密切的聯(lián)系，也證實胃動素可在影響中樞神經(jīng)元細(xì)胞靜息電位的基礎(chǔ)上，發(fā)揮其增強(qiáng)胃腸運動的作用。由于Ca2+也可作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的第二信使發(fā)揮其生理作用，具體通過哪種轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，將在以后研究中進(jìn)行探討。

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