繆敏慧，孟紅委，倪紅元，戴如順，王 敏，杜 鴻（蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇蘇州 215004）

傷寒沙門菌是沙門菌屬中經(jīng)消化道感染人類的致病菌之一，可導(dǎo)致感染患者發(fā)生全身系統(tǒng)性感染，并能引發(fā)腸穿孔等嚴(yán)重的并發(fā)癥，進(jìn)而危及感染患者的生命［1－2］。傷寒沙門菌作為食源性致病菌，必須克服人體腸道內(nèi)的高滲應(yīng)激環(huán)境才能最終致病。筆者在前期的研究工作中發(fā)現(xiàn)，在高滲應(yīng)激環(huán)境下，傷寒沙門菌t4606基因的表達(dá)受到兩個(gè)重要的sigma因子，即RpoE和RpoS的雙重調(diào)控［3］，提示t4606基因?qū)抽T菌克服高滲應(yīng)激環(huán)境極為重要。本研究利用原核生物基因敲除技術(shù)制備了傷寒沙門菌t4606基因缺陷株，并分析了其在高滲應(yīng)激環(huán)境下的生物學(xué)特性，旨在通過(guò)分析t4606基因的功能，及其在沙門菌致病機(jī)制中的作用，為臨床治療和預(yù)防傷寒沙門菌感染提供可能的靶向基因。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 本試驗(yàn)所采用的傷寒沙門菌、自殺質(zhì)粒及大腸埃希菌（E.coli）DH5α菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑 核酸限制性內(nèi)切酶BglⅡ、BamHⅠ及用于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的EXTaq酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒提取試劑、膠回收試劑及T4DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 t4606基因缺陷株的制備 利用原核生物基因同源重組技術(shù)制備t4606缺陷變異株，篩選連續(xù)3次傳代均獲得穩(wěn)定重組的菌株作為t4606基因缺陷變異株，并采用序列分析進(jìn)行驗(yàn)證。具體方法參考文獻(xiàn)［4］。相關(guān)引物見(jiàn)表1。

1.3.2 t4606基因缺陷株回補(bǔ)株的制備 設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增t4606基因全長(zhǎng)，上、下游引物的5′端分別加入NcoⅠ、SalⅠ酶切位點(diǎn)（見(jiàn)表1），擴(kuò)增獲得的全長(zhǎng)片段經(jīng)酶切后與表達(dá)載體pBAD／gⅢ（阿拉伯糖操縱元）連接，克隆至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用質(zhì)粒的氨芐西林抗性初步篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，篩選獲得的陽(yáng)性重組質(zhì)粒采用PCR及序列分析進(jìn)行驗(yàn)證（由上海生工生物技術(shù)公司完成）。培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)證確定的陽(yáng)性重組菌株，提取重組質(zhì)粒pBADt4606，電擊導(dǎo)入t4606變異株，經(jīng)酶切及PCR驗(yàn)證后命名為回補(bǔ)菌Δt4606（pBADt4606）。采用質(zhì)量體積比（W／V）為0.2%的阿拉伯糖誘導(dǎo)質(zhì)粒表達(dá)，具體方法參考文獻(xiàn)［5］。

表1 PCR引物及序列

1.3.3 生長(zhǎng)曲線分析 基因缺陷株、缺陷回補(bǔ)株和野生株分別在37℃條件下，于LB培養(yǎng)液中振搖培養(yǎng)過(guò)夜；過(guò)夜培養(yǎng)后以1∶100的比例轉(zhuǎn)入新鮮、預(yù)熱的LB培養(yǎng)液，每隔1h檢測(cè)培養(yǎng)液在600nm處的吸光度值（A600值），以A600值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。用相同方法比較t4606缺陷株和野生株在高滲應(yīng)激（300mmol／L NaCl）環(huán)境下的生存能力。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期（培養(yǎng)4h）和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期（12h）比較不同菌株培養(yǎng)液的A600值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)；P＜0.05為比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 成功制備t4606基因缺陷株 首先利用自殺質(zhì)粒所具有的氨芐西林抗性，在含有氨芐西林的LB平板上篩選具有抗性的菌落，再進(jìn)一步篩選耐蔗糖的菌落。以篩選獲得的陽(yáng)性菌落DNA為模板，用t4606基因上、下游引物P1A和P2B進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析傷寒沙門菌t4606基因的重組變異情況。PCR擴(kuò)增檢測(cè)相應(yīng)菌落，直至篩選獲得連續(xù)傳代超過(guò)3次均僅有缺損片段的菌株。所獲得的菌株即為穩(wěn)定的t4606基因缺陷株。缺陷株及野生株P(guān)CR產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。經(jīng)DNA序列分析，進(jìn)一步證實(shí)702bp處被BglⅡ核酸限制性內(nèi)切酶的6個(gè)堿基酶切位點(diǎn)所替代。

圖1 t4606缺陷株及野生株P(guān)CR產(chǎn)物電泳圖

2.2 成功構(gòu)建回補(bǔ)菌株Δt4606（pBADt4606） 為進(jìn)一步證實(shí)t4606基因的功能，利用表達(dá)載體pBAD／gⅢ將t4606基因回補(bǔ)引入t4606基因缺陷株，構(gòu)建回補(bǔ)菌株Δt4606（pBADt4606）。利用質(zhì)粒的氨芐西林抗性，初步篩選攜帶回補(bǔ)t4606基因質(zhì)粒的細(xì)菌后，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切及PCR驗(yàn)證，酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。DNA序列分析證實(shí)堿基序列與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一致。

圖2 回補(bǔ)t4606基因的鑒定

2.3 生長(zhǎng)曲線分析 于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期（培養(yǎng)4h）和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期（12h）檢測(cè)并比較不同菌株培養(yǎng)液的A600值，結(jié)果顯示，高滲應(yīng)激環(huán)境下t4606缺陷株（Δt4606）的生存能力明顯弱于野生株（4h：t＝22.725，P＜0.05；12h：t＝5.008，P＜0.05），回補(bǔ)t4606基因至t4606缺陷株后，細(xì)菌生存能力恢復(fù)至野生株水平（4h：t＝3.559，P＞0.05；12h：t＝0.404，P＞0.05），說(shuō)明t4606基因在細(xì)菌適應(yīng)高滲應(yīng)激環(huán)境時(shí)發(fā)揮了重要作用。生長(zhǎng)曲線如圖3所示。

圖3 不同菌株在高滲應(yīng)激環(huán)境下的生存曲線

3 討 論

傷寒沙門菌作為食源性致病菌，常通過(guò)污染食物而經(jīng)消化道入人體內(nèi)，進(jìn)而造成全身性感染，嚴(yán)重時(shí)可危及感染患者的生命。全球每年約有2 100 萬(wàn)人感染傷寒沙門菌，其中死亡人數(shù)超過(guò)21萬(wàn)，即使在發(fā)達(dá)國(guó)家，傷寒沙門菌的暴發(fā)流行也時(shí)有發(fā)生［6］。傷寒沙門菌在致病過(guò)程中，必須克服人體腸道內(nèi)的高滲應(yīng)激環(huán)境才能最終致病［7－8］。在應(yīng)激環(huán)境下，細(xì)菌需要及時(shí)有效地調(diào)節(jié)某些基因的表達(dá)和蛋白的活性，從而適應(yīng)新的環(huán)境。盡管傷寒沙門菌已成為重要的原核生物研究模式菌，其全基因組結(jié)構(gòu)也已闡明，然而仍然有近三分之一基因的功能尚不明確，而這些基因在細(xì)菌生存過(guò)程中可能具有極為重要的生物學(xué)作用。隨著一些未知基因功能的逐步明確，對(duì)傷寒沙門菌致病機(jī)制的認(rèn)識(shí)也將進(jìn)一步深入。然而，如何選擇在傷寒沙門菌適應(yīng)應(yīng)激環(huán)境時(shí)發(fā)揮重要作用的未知功能基因，是后續(xù)研究工作中的難點(diǎn)。

筆者前期利用傷寒沙門菌全基因組芯片，研究了高滲應(yīng)激環(huán)境下的兩個(gè)重要調(diào)節(jié)因子（RpoE和RpoS）的雙重調(diào)控作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在傷寒沙門菌處于高滲應(yīng)激環(huán)境時(shí)，t4606基因的表達(dá)同時(shí)受到RpoE和RpoS的雙重調(diào)控，說(shuō)明t4606基因在傷寒沙門菌適應(yīng)高滲應(yīng)激環(huán)境方面具有重要的意義［3］。進(jìn)一步利用生物信息學(xué)軟件對(duì)t4606基因序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，t4606基因具有70%的Patatin樣磷脂酶基序，可能編碼一種Patatin樣磷脂酶。Patatin樣磷脂酶和細(xì)菌的侵襲性和毒力密切相關(guān)。Banerji和Flieger［9］的研究表明，具有致病性的細(xì)菌內(nèi)，含有Patatin樣編碼區(qū)域的蛋白比非致病性細(xì)菌更為常見(jiàn)。也有研究表明，銅綠假單胞菌肺炎患者體內(nèi)出現(xiàn)急性肺損傷，有可能是由銅綠假單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的ExoU毒素進(jìn)入真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)所致［10］。ExoU毒素由exoU基因編碼，而exoU基因類似于傷寒沙門菌t4606基因，其所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列中具有Patatin樣磷脂酶片段，且該片段與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的非鈣離子依賴性磷脂酶A2具有同源性，并且ExoU毒素的溶血磷酸酶A活性和細(xì)胞毒作用與該片段有關(guān)［10］。傷寒沙門菌中是否存在Patatin樣磷脂酶尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，值得進(jìn)一步深入研究。

本研究采用分子生物學(xué)技術(shù)，結(jié)合t4606基因的特性，通過(guò)優(yōu)化相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件，成功制備了傷寒沙門菌t4606基因缺陷株及其回補(bǔ)株，并觀察了不同菌株在模擬人體腸道高滲應(yīng)激環(huán)境下的生存能力。通常情況下，腸道致病菌在進(jìn)入人體腸道后，必須適應(yīng)環(huán)境滲透壓的巨大改變，即從食物中的低滲環(huán)境到腸道內(nèi)的高滲環(huán)境。致病菌只有適應(yīng)了新的滲透壓環(huán)境，才能侵襲腸上皮細(xì)胞。因此，了解傷寒沙門菌適應(yīng)人體腸道內(nèi)高滲應(yīng)激環(huán)境的機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步分析傷寒沙門菌的整體致病機(jī)制具有重要的意義。本研究中的生長(zhǎng)曲線分析證實(shí)，高滲應(yīng)激環(huán)境下，t4606缺陷株的生長(zhǎng)能力明顯弱于野生株，但在回補(bǔ)t4606基因至t4606缺陷株后，其生長(zhǎng)能力恢復(fù)至野生株水平。由此可見(jiàn)，t4606基因在傷寒沙門菌適應(yīng)高滲應(yīng)激環(huán)境方面發(fā)揮著重要的作用。

本文對(duì)高滲應(yīng)激環(huán)境下傷寒沙門菌t4606基因的生物學(xué)功能進(jìn)行了初步研究，為進(jìn)一步深入了解t4606基因在傷寒沙門菌中發(fā)揮作用的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也說(shuō)明t4606有可能作為臨床預(yù)防和治療傷寒沙門菌感染的靶向基因，為傷寒沙門菌感染的臨床分子靶向治療提供了新的研究方向。

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