黃麗萍，王興林，張 冷，畢 勝，林碧文解放軍總醫(yī)院，北京 00853；大連市中醫(yī)醫(yī)院，遼寧大連 603

紫杉醇對(duì)兔耳增生性瘢痕的作用

黃麗萍1，王興林1，張 冷2，畢 勝1，林碧文1
1解放軍總醫(yī)院，北京 100853；2大連市中醫(yī)醫(yī)院，遼寧大連 116032

目的觀察藥物紫杉醇對(duì)兔耳增生性瘢痕的作用。方法 在兔耳腹側(cè)面建立增生性瘢痕模型，將紫杉醇藥品配制成濃度為12 mg/L、24 mg/L、48 mg/L、96 mg/L；18 mg/L、54 mg/L、162 mg/L、486 mg/L；30 mg/L、150 mg/L、750 mg/L、3 750 mg/L的藥液，觀察不同濃度的藥物對(duì)兔耳增生性瘢痕的作用，尋找療效最佳的藥物濃度。結(jié)果在48 ～ 162 mg/L濃度范圍內(nèi)，兔耳瘢痕增生指數(shù)隨藥物濃度的增加而減少。結(jié)論紫衫醇對(duì)兔耳增生性瘢痕的成纖維細(xì)胞增殖、膠原沉積、微血管增生均有抑制作用。

增生性瘢痕；紫杉醇；模型，動(dòng)物

病理性瘢痕的形成，與傷口愈合過程中皮膚成纖維細(xì)胞大量增殖與凋亡障礙、細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂、組織微血管過度增生等因素密切相關(guān)[1-2]。紫杉醇是從紅豆杉屬植物中提取的一種具有抗癌、抗微管增生作用的藥物，有研究表明紫杉醇可以抑制成纖維細(xì)胞的增殖以及血管的形成[3]。我們將不同濃度的紫杉醇藥液以瘢痕內(nèi)注射的形式作用于兔耳瘢痕模型上，觀察紫杉醇對(duì)瘢痕組織的作用，驗(yàn)證藥物療效、摸索藥物應(yīng)用的最佳濃度范圍。

材料和方法

1 材料 紫杉醇注射液(生產(chǎn)廠家：Corden Pharma Latina S.P.A；規(guī)格：5 ml：30 mg；進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)H20110470)，蘇木素-伊紅、天狼猩紅染液、酸性品紅液、苯胺藍(lán)液。日本大耳白兔18只，兔耳健全，體質(zhì)量2.0 ～ 2.5 kg。

2 增生性瘢痕動(dòng)物模型的建立 將動(dòng)物麻醉后，兔耳腹側(cè)面去毛，消毒鋪洞巾，避開血管，于每只兔耳腹側(cè)面中線兩側(cè)分別做4個(gè)1.5 cm×1.5 cm方形全層皮膚缺損創(chuàng)面，用手術(shù)刀刮除軟骨膜、保留軟骨，36只兔耳共144個(gè)創(chuàng)面，制成后創(chuàng)面包扎，術(shù)后第2天摘除敷料，暴露創(chuàng)面，待其自然愈合。見圖1。

3 藥物配制 紫杉醇注射液(濃度為6 000 mg/L)，以注射用水稀釋，以6 mg/L為基礎(chǔ)濃度，按2倍、3倍和5倍濃度梯度遞增，分別配制成濃度為12 mg/L、24 mg/L、48 mg/L、96 mg/L；18 mg/L、54 mg/L、162 mg/L、486 mg/L；30 mg/L、150 mg/L、750 mg/L、3 750 mg/L的藥液。

4 藥物注射與取材 每只兔子兩耳共8個(gè)瘢痕組織塊，于造模術(shù)后28 d兔耳瘢痕生長(zhǎng)最高峰時(shí)，取1個(gè)組織塊作為空白對(duì)照，僅注射注射用水，1個(gè)注射基礎(chǔ)濃度6 mg/L的藥液，其余6個(gè)瘢痕組織塊按濃度梯度遞增，分別被注射6個(gè)不同濃度的藥液。給藥方法：以1 ml注射器從兔耳瘢痕邊緣基底部選取3 ～ 5個(gè)進(jìn)針點(diǎn)，以瘢痕灶中心為進(jìn)針方向，在針體行進(jìn)過程中逐步推針管給藥，注射完畢后局部壓迫1 ～ 2 min以防藥液從針孔滲漏。每個(gè)瘢痕塊注射藥液總量為0.8 ml。用藥后10 d取材，中性甲醛固定48 h，石蠟包埋。

5 測(cè)定瘢痕增生指數(shù)(hypertrophic index，HI) HE染色切片低倍鏡下用顯微測(cè)量尺測(cè)量，按公式：HI=A/B計(jì)算瘢痕增生指數(shù)[4]。見圖2。

圖 1 兔耳瘢痕造模手術(shù)示意圖Fig. 1 Rabbit ear scar operation model

圖 2 瘢痕增生指數(shù)(HI)計(jì)算示意圖： 瘢痕最高點(diǎn)至軟骨表面的垂直厚度(A)，正常皮膚至軟骨表面的垂直厚度(B)，兔耳軟骨(C)，HI=A/BFig. 2 Calculation of hyperplastic scar index A: The vertical thickness from the top of scar to the cartilage surface; B: The vertical thickness from the normal skin to cartilage surface;C: The rabbit ear cartilage

6 成纖維細(xì)胞密度 HE染色切片，400倍光鏡下用Lumenera Infinity2-1 CDD相機(jī)動(dòng)態(tài)觀察并進(jìn)行矩形視野選擇，在瘢痕厚度最大區(qū)域內(nèi)，于淺部、深部各選擇3個(gè)不重疊視野；在瘢痕兩側(cè)邊緣各選2個(gè)不重疊視野，共10個(gè)視野。每個(gè)視野按相同的平行網(wǎng)格進(jìn)行區(qū)域劃分，分別統(tǒng)計(jì)各網(wǎng)格內(nèi)的成纖維細(xì)胞數(shù)求和即為該矩形視野的總成纖維細(xì)胞數(shù)。10個(gè)矩形視野分別計(jì)數(shù)，結(jié)果取均數(shù)即為該張切片的成纖維細(xì)胞密度。

7 膠原纖維面密度 天狼猩紅染色切片，400倍光鏡下在瘢痕淺部和深部、兩側(cè)邊緣部各隨機(jī)選取10個(gè)視野，應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助病理圖像分析系統(tǒng)計(jì)算紅染膠原面的密度，結(jié)果取均數(shù)[5-6]。

8 微血管密度 HE染色切片切片，400倍光鏡下選擇血管密集的區(qū)域，計(jì)數(shù)5個(gè)視野內(nèi)的微血管(管腔＞8個(gè)紅細(xì)胞直徑的微血管則不計(jì)數(shù))，取其平均數(shù)即為微血管增生密度。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用EXCEL建立數(shù)據(jù)庫，SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以表示。采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HE染色 空白對(duì)照組：可見瘢痕組織中成纖維細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞體積較大，微血管較豐富，可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)。瘢痕組織淺層膠原纖維致密，排列紊亂，多為Ⅰ型膠原纖維。深層膠原纖維呈線條狀排列，無規(guī)律，膠原纖維較淺層長(zhǎng)(圖3A)；紫杉醇治療組(濃度162 mg/L)：成纖維細(xì)胞數(shù)量較治療前減少，膠原疏松呈線條狀排列，微血管較用藥前稀疏(圖3B)。

2 天狼猩紅染色 空白對(duì)照組：瘢痕組織內(nèi)膠原纖維呈不規(guī)則的纖維網(wǎng)狀條索，分布密集，纖維較粗大(圖4A)；紫杉醇治療組：瘢痕組織內(nèi)膠原纖維排列較規(guī)則，較空白對(duì)照組稀疏，纖維較纖細(xì) (圖 4B)。

圖 3 HE染色下空白對(duì)照組(A)與治療組(B)的瘢痕組織成纖維細(xì)胞、膠原及血管(×200)Fig. 3 HE staining (×200) showing fi broblasts, collagen and blood vessels in scar tissue of control group (A) and treatment group (B)

圖 4 天狼猩紅染色下空白對(duì)照組(A)與治療組(B)的瘢痕組織膠原示意圖(×400)Fig. 4 Sirius red staining (×400) showing collagen in scar tissue of control group (A) and treatment group (B)

圖 5 三色染色下空白對(duì)照組(A)與治療組(B)的瘢痕組織大體觀察及血管、膠原情況(×40)Fig. 5 Masson trichrome staining (×40) showing blood vessels and collagen in scar tissue of control group (A) and treatment group (B)

表1 不同濃度的紫杉醇藥液對(duì)兔耳瘢痕增生指數(shù)、成纖維細(xì)胞、膠原、微血管密度的影響Tab. 1 Effect of paclitaxel at different concentrations on hyperplastic scars, fi broblasts, collagen and micro-vessels of rabbit ear scar

3 三色染色 空白對(duì)照組：瘢痕較厚，血管豐富，膠原密集(圖5A)；紫杉醇治療組：瘢痕較平坦，血管減少，膠原密度較對(duì)照組低(圖5B)。

4 不同濃度紫杉醇藥液的作用效果 當(dāng)紫杉醇藥液濃度＞400 mg/L時(shí)，兔耳瘢痕組織會(huì)出現(xiàn)局部壞死；與空白組比較，藥液濃度為96 mg/L、150 mg/L、162 mg/L時(shí)療效顯著。見表1。

討 論

病理性瘢痕的形成是十分復(fù)雜的生物學(xué)過程，從組織形態(tài)上是以成纖維細(xì)胞為主的過度增殖，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原過量沉積、排列紊亂，且難以被機(jī)體吸收或重塑的病理狀態(tài)[7-9]。瘢痕的實(shí)驗(yàn)研究一般包括離體細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物造模和臨床實(shí)驗(yàn)觀察3種形式[10]。在體外細(xì)胞模型中，多為將病理性瘢痕組織中的成纖維細(xì)胞體培養(yǎng)、人工傳代后，將各類干預(yù)手段作用于細(xì)胞[7]。它的局限性在于人工細(xì)胞培養(yǎng)的外環(huán)境與人體復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境有較大差異，作用條件單一，在體外細(xì)胞模型上得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往有偏移。將各種治療手段直接作用于病理性瘢痕的病變局部，雖然可以得出較可靠、直接的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但實(shí)驗(yàn)的受限條件較多且取材不便。因而許多學(xué)者選擇在動(dòng)物模型上進(jìn)行治療病理性瘢痕的新療法或藥物的研究。目前較公認(rèn)的動(dòng)物模型有裸鼠模型和兔耳瘢痕模型[11-14]。裸鼠模型是將人類瘢痕的組織移植于裸鼠皮膚上進(jìn)行生長(zhǎng)，但由于物種差異較大，移植后因免疫排斥反應(yīng)等因素，移植的人類瘢痕組織會(huì)發(fā)生萎縮，影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。兔耳瘢痕模型是在瘢痕研究中被較多應(yīng)用的另一類動(dòng)物模型，兔耳腹側(cè)面缺乏肉膜結(jié)構(gòu)，創(chuàng)面的修復(fù)、愈合過程及瘢痕形成后的組織病理學(xué)特點(diǎn)與人類瘢痕的形成有許多相似處。因此，在本研究中我們采用了兔耳瘢痕模型作為研究對(duì)象，在成功生長(zhǎng)于兔耳腹側(cè)面的瘢痕組織上以局部注射的方式給藥，并觀察不同藥物濃度對(duì)兔耳瘢痕組織的作用，摸索藥物作用的最佳濃度范圍。紫杉醇是已被臨床廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥物，它通過進(jìn)入靶細(xì)胞與細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)合，促進(jìn)微管聚集、阻礙微管正常的生理性解聚，從而使細(xì)胞增殖受阻，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，紫杉醇對(duì)膠原合成及成纖維細(xì)胞的過度增生均有抑制作用，此外紫杉醇還具有抗微血管增生的作用[15-16]。我們觀察到，在48 ～ 162 mg/L濃度范圍內(nèi)，兔耳瘢痕增生指數(shù)隨藥物濃度的增加而減少。在病理觀察中我們發(fā)現(xiàn)，用藥后的兔耳瘢痕組織中，無明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞密度降低，部分細(xì)胞胞核淡染，呈現(xiàn)凋亡現(xiàn)象；而對(duì)照組兔耳瘢痕組織中，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，成纖維細(xì)胞密度較用藥組顯著增高，真皮層中可見大量排列無序、細(xì)胞核呈深染狀態(tài)的成纖維細(xì)胞。進(jìn)一步驗(yàn)證了紫杉醇可直接抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)增殖這一結(jié)論[17]。在病理性瘢痕的形成中，膠原纖維是組織構(gòu)成的結(jié)構(gòu)性支架，具有極其重要的作用[18]。在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到，空白對(duì)照組的瘢痕組織中，膠原纖維粗大，排列紊亂、屈曲扭結(jié)、呈環(huán)狀改變；而用藥后的瘢痕組織中，膠原纖維纖細(xì)、排列規(guī)則有序，密度較空白對(duì)照組顯著降低。瘢痕組織的生長(zhǎng)需要血管的增殖和架構(gòu)，紫杉醇因具有抗微血管增生的作用，故可抑制病理性瘢痕組織的形成，經(jīng)藥物處理后的瘢痕組織血管密度較空白組明顯減小，組織體積較對(duì)照組明顯萎縮。在大體目測(cè)觀察中我們還發(fā)現(xiàn)，在48 ～ 162 mg/L這一濃度范圍內(nèi)，以注射方式給藥的紫衫醇藥液不但可抑制兔耳瘢痕的增生，而且對(duì)瘢痕表皮的破壞較小，無組織潰爛、壞死，作用溫和，是較理想的抗瘢痕藥物[19]。

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Role of paclitaxel in treatment of hyperplastic scars on rabbit ears

HUANG Li-ping1, WANG Xing-lin1, ZHANG Leng2, BI Sheng1, LIN Bi-wen1
1Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Dalian Hospital of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116032, Liaoning Province, China
Corresponding author: WANG Xing-lin. Email: Wangxingl301@126.com

ObjectiveTo observe the role of paclitaxel in treatment of hyperplastic scars on rabbit ears.MethodsA rabbit ear hyperplastic scar model was established. The role of paclitaxel in treatment of hyperplastic scars on rabbit ears was observed at the concentrations of 12 mg/L, 24 mg/L, 48 mg/L, 96 mg/L, 18 mg/L, 54 mg/L, 162 mg/L, 486 mg/L, 30 mg/L, 150 mg/L, 750 mg/L, and 3 750 mg/L, respectively. Results Paclitaxel at the concentration of 48-162 mg/L reduced the number of hyperplastic scars on rabbit ears.ConclusionPaclitaxel can inhibit the proliferation of fi broblasts, deposition of collagen, and micro-angiogenesis in hyperplastic scars on rabbit ears.

hyperplastic scar; paclitaxel; models, animal

R363

A

2095-5227(2014)05-0485-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.05.024

2013-09-25

解放軍總醫(yī)院臨床科研扶持基金(2013FC-TSYS-1027)

黃麗萍，女，博士，主治醫(yī)師。研究方向：瘢痕康復(fù)、體表射頻消融。Email: ping-online@163.com

王興林，男，碩士，教授，主任醫(yī)師。Email: Wangxingl301@126.com