高旭鵬，彭 江，孫 遜，郭志遠(yuǎn)，王 玉，盧世璧，趙 慶

解放軍總醫(yī)院 骨科研究所，北京 100853

周圍神經(jīng)Wallerian變性不同時間點(diǎn)對干細(xì)胞歸巢的趨化作用

高旭鵬，彭 江，孫 遜，郭志遠(yuǎn)，王 玉，盧世璧，趙 慶

解放軍總醫(yī)院 骨科研究所，北京 100853

目的觀察周圍神經(jīng)損傷后不同時間點(diǎn)Wallerian變性對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)歸巢的影響。方法 成年雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量220 ～ 250 g，按體質(zhì)量編號隨機(jī)分為6組(n=12)，每組內(nèi)再按注射細(xì)胞和藥物的不同隨機(jī)分為A、B兩組，A組(n=6)經(jīng)尾靜脈注射紅色熒光間充質(zhì)干細(xì)胞(red fluorescence proteinbone marrow mesenchymal stem cells，RFP-BMSCs)和0.9%氯化鈉注射液，B組(n=6)經(jīng)尾靜脈注射RFP-BMSCs和膜蛋白CXCR4特異性拮抗劑(AMD3100)；所有實(shí)驗(yàn)動物均在無菌條件下暴露坐骨神經(jīng)，并于梨狀肌下緣切斷坐骨神經(jīng)，近端結(jié)扎，遠(yuǎn)端曠置，然后分別在坐骨神經(jīng)切斷后的1 d、3 d、7 d、14 d、1個月、2個月行尾靜脈RFP-BMSCs+0.9%氯化鈉注射液(A組)和RFP-BMSCs+AMD3100(B組)注射，并在注射后的第3天行活體成像系統(tǒng)觀察。結(jié)果隨著時間的延長，RFPBMSCs在發(fā)生Wallerian變性的坐骨神經(jīng)中的聚集呈現(xiàn)先增高后降低的現(xiàn)象；坐骨神經(jīng)Wallerian變性的早期(1 ～ 3 d)，注射RFP-BMSCs+AMD3100(B組)的RFP-BMSCs聚集現(xiàn)象明顯弱于RFP-BMSCs+0.9%氯化鈉注射液(A組)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論干細(xì)胞可以向發(fā)生Wallerian變性的神經(jīng)組織聚集，在不同的時間點(diǎn)，其歸巢現(xiàn)象存在先增高后降低的現(xiàn)象；在Wallerian變性的早期，其歸巢現(xiàn)象可能部分受到SDF-1-CXCR4軸的調(diào)控，可以被CXCR4特異性拮抗劑AMD3100所抑制。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；周圍神經(jīng)損傷；干細(xì)胞歸巢

間充質(zhì)干細(xì)胞在某些信號的影響下具有向某類組織遷移聚集的能力，被稱之為細(xì)胞歸巢。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作為一種被深入研究的組織工程種子細(xì)胞，不僅具有促進(jìn)神經(jīng)軸突生長，分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，調(diào)控雪旺細(xì)胞活性等作用，而且能夠通過SDF1-CXCR4等細(xì)胞通路向中樞神經(jīng)、心肌等損傷部位遷移和歸巢，參與修復(fù)過程[1-6]。周圍神經(jīng)損傷后，其遠(yuǎn)端發(fā)生一系列代謝及結(jié)構(gòu)變化，稱為Wallerian變性[7]。Wallerian變性的神經(jīng)能否趨化骨髓干細(xì)胞歸巢，其時間特點(diǎn)如何，以及能否被CXCR4的特異性抑制劑AMD3100所抑制？本實(shí)驗(yàn)嘗試采用活體成像系統(tǒng)觀察周圍神經(jīng)損傷后不同時間Wallerian變性對BMSCs歸巢能力的影響。

材料和方法

1 主要材料與儀器 OriCellTM表達(dá)紅色熒光蛋白(red fluorescent protein-bone marrow stromal cells，RFP-BMSCs)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，由賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司提供。SD大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基[賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司]，0.25%胰蛋白酶(Gibco公司，美國)，10%胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物工程有限公司)，10 μmol/ml AMD3100(SIGMA公司，美國)，CO2培養(yǎng)箱B5060型(Hereus公司，德國)，光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)BX51型(Olympus公司，日本)，圖像分析系統(tǒng)Image Pro Plus(Media Cybernetics公司，美國)，小動物活體成像系統(tǒng)NightOwlⅡLB 983型(Berthold公司，德國)，生物凈化臺SW-CJ-1F(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)動物 成年雄性SD大鼠72只，清潔級，體質(zhì)量220 ～ 250 g；均由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

3 大鼠RFP-BMSCs的體外培養(yǎng) 將凍存的第3代RFP-BMSCs(由廣州賽業(yè)生物科技有限公司提供)在1 800 r/m條件下離心5 min，收集細(xì)胞成分，置于含血清的培養(yǎng)液中；在5% CO2、37℃下培養(yǎng)，每3 ～ 4 d更換新培養(yǎng)液；在細(xì)胞生長達(dá)到80% ～90%融合的時候，使用Hank's液洗滌2次，使用含0.25%胰酶的胰酶液在37℃下消化3 min，胎牛血清終止消化，然后按照1∶3的比例接種于新的培養(yǎng)瓶，獲得穩(wěn)定表達(dá)RFP的細(xì)胞。同法擴(kuò)增細(xì)胞至第5代，備用。

4 細(xì)胞免疫熒光檢測RFP-BMSCs的CXCR4表達(dá)對大鼠第4代RFP-BMSCs爬片，并使用CXCR4抗體行免疫熒光染色，Hoechst 33258標(biāo)記細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察CXCR4在RFP-BMSCs在細(xì)胞膜上的分布。

5 周圍神經(jīng)損傷模型的建立 取SD大鼠72只，按體質(zhì)量編號隨機(jī)分為6組(n=12)，每組內(nèi)再按注射細(xì)胞和藥物的不同隨機(jī)分為A和B兩個小組，A組(n=6)經(jīng)尾靜脈注射RFP-BMSCs和0.9%氯化鈉注射液，B組(n=6)經(jīng)尾靜脈注射RFP-BMSCs和膜蛋白CXCR4特異性拮抗劑(AMD3100)。電子秤稱量大鼠體質(zhì)量，采用10%的水合氯醛0.3 ml/100 g行腹腔注射麻醉，麻醉穩(wěn)定的大鼠剃除右側(cè)后肢被毛，固定于手術(shù)臺上，俯臥位。碘伏消毒雙后肢，鋪手術(shù)單，縱向剪開右后肢背側(cè)皮膚1.5 ～ 2 cm，分離皮下組織及肌肉，沿肌間隙暴露坐骨神經(jīng)至梨狀肌下，在梨狀肌下緣使用顯微剪斷坐骨神經(jīng)主干，近端2/0結(jié)扎，遠(yuǎn)端曠置，逐層縫合肌肉皮膚，松開大鼠，放鼠回籠。

6 RFP-BMSCs的尾靜脈注射移植及AMD3100尾靜脈注射干預(yù) 所有SD大鼠于造模后1 d、3 d、7 d、14 d、1個月、2個月行尾靜脈RFP-BMSCs+0.9%氯化鈉注射液(A組)和RFP-BMSCs+AMD3100(B組)注射。步驟：以0.25%胰酶收集RFP-BMSCs，并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以無血清DMEM液重懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml，使用特制固定器固定大鼠，以溫水浸泡鼠尾，使尾靜脈擴(kuò)張。A組從尾靜脈緩慢注射0.9%氯化鈉注射液0.5 ml，B組注射無菌PBS稀釋的終濃度為10 μmol/ml AMD3100溶液0.5 ml，30 min后A、B兩組分別經(jīng)尾靜脈注射0.5 ml細(xì)胞懸液，注射時間為5 min[8-10]。

7 活體成像系統(tǒng)檢測RFP-BMSCs向損傷神經(jīng)段的歸巢 由于被激發(fā)的RFP-BMSCs的紅色熒光無法穿透肥厚的SD大鼠的肌肉組織，因此我們通過處死SD大鼠獲取神經(jīng)組織來對其直接進(jìn)行觀察。各組SD大鼠于細(xì)胞靜脈移植后3 d處死，取術(shù)側(cè)和檢測神經(jīng)段行活體成像檢測：采用過量10%的水合氯醛行腹腔注射處死大鼠，固定于手術(shù)臺上，俯臥位，縱向剪開雙后肢背側(cè)皮膚，分離皮下組織及肌肉，沿肌間隙暴露坐骨神經(jīng)，手術(shù)顯微鏡下在皮神經(jīng)分叉遠(yuǎn)端使用顯微剪斷取下雙側(cè)坐骨神經(jīng)主干，長度約1.5 cm，剔除神經(jīng)周圍結(jié)締組織，4℃PBS中保存。將修剪好的雙側(cè)坐骨神經(jīng)平放于黑色背景紙上，置于活體成像系統(tǒng)中，使用環(huán)狀激發(fā)光源均勻激發(fā)成像，激發(fā)光波長為530 nm，曝光時間1 s。使用IndiGo圖像系統(tǒng)分析得到的熒光圖像，可獲得每份神經(jīng)組織上的平均光子強(qiáng)度，將每組各只動物右側(cè)損傷神經(jīng)與左側(cè)正常對照神經(jīng)的平均熒光光子強(qiáng)度比值進(jìn)行比較。

8 神經(jīng)組織免疫熒光染色 取活體成像系統(tǒng)檢測完的神經(jīng)組織，行冷凍切片，厚度為10 μm，Hoechst 33258標(biāo)記細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察RFP-BMSCs在神經(jīng)組織中的分布。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，以表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RFP-BMSCs體外培養(yǎng)普通光鏡及熒光顯微鏡觀察 SD大鼠RFP-BMSCs在復(fù)蘇12 h后開始貼壁生長，24 h后開始增殖，細(xì)胞的集落增多，呈現(xiàn)典型的間充質(zhì)干細(xì)胞的“漩渦狀”生長方式(圖1A)，4 ～ 5 d后可傳代，熒光顯微鏡觀察穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光(圖1B)。

2 RFP-BMSCs免疫熒光染色 對第4代RFP-BMSCs行免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞自身表達(dá)紅色熒光(圖2A)，綠色熒光標(biāo)記CXCR4膜蛋白(圖2B)，藍(lán)色標(biāo)記細(xì)胞核(圖2C)。由此，CXCR4蛋白廣泛表達(dá)于RFP-BMSCs中(圖2D)。

3 Wallerian變性神經(jīng)段大體觀察 周圍神經(jīng)損傷后，其遠(yuǎn)端發(fā)生一系列代謝及結(jié)構(gòu)變化，稱為Wallerian變性，變性的神經(jīng)較健側(cè)粗大。見圖3。

4 RFP-BMSCs向損傷的神經(jīng)段歸巢的熒光成像在1 d、3 d、7 d、14 d、1個月、2個月不同時間點(diǎn)，A組(RFP-BMSCs+0.9%氯化鈉注射液)和B組(RFP-BMSCs+AMD3100)術(shù)側(cè)熒光強(qiáng)度均強(qiáng)于對側(cè)；另外，在每個時間點(diǎn)，A組(RFP-BMSCs+0.9%氯化鈉注射液)的術(shù)側(cè)熒光強(qiáng)度均強(qiáng)于B組(RFPBMSCs+AMD3100)術(shù)側(cè)。見圖4。

5 損傷側(cè)與健側(cè)的神經(jīng)熒光成像平均光子密度比值比較 不同時間點(diǎn)的RFP-BMSCs+0.9%氯化鈉注射液組的光子強(qiáng)度比值具有先增高后降低的趨勢，并且在7 d的時間點(diǎn)達(dá)到頂峰；1 d與3 d、7 d比較、7 d與14 d比較，RFP-BMSCs組的光子強(qiáng)度比值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1、圖5。在1 d和3 d兩個時間點(diǎn)，RFP-BMSCs組的平均光子強(qiáng)度比值高于RFP-BMSCs+AMD3100組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1、圖6。

6 神經(jīng)組織免疫熒光染色 熒光顯微鏡下觀察，RFP-BMSCs在某些趨化因子的作用下遷徙到了損傷的神經(jīng)組織內(nèi)。另外，該病理結(jié)果也提示我們活體成像系統(tǒng)是一種可信賴的用于觀察干細(xì)胞歸巢現(xiàn)象的方法。見圖7。

討 論

圖 1 復(fù)蘇增殖的第4代RFP-BMSCs A： 倒置相差顯微鏡觀察(×100)； B： 熒光顯微鏡觀察(×100)Fig. 1 The fourth generation of BMSCs under inverted phase contrast microscope (A, ×100) and fl uorescence microscope(B, ×100)

圖 2 熒光顯微鏡觀察第4代RFP-BMSCs的CXCR4表達(dá)A： 紅色熒光顯示RFP表達(dá)陽性細(xì)胞； B： 綠色熒光顯示CXCR4表達(dá)陽性細(xì)胞； C： 藍(lán)色熒光顯示Hoechst 33258標(biāo)記的細(xì)胞核； D： A、 B和C圖疊加Fig. 2 Red fl uorescence microscopy (A) showing CXCR4 expression in BMSCs, green fluorescence microscopy (B) showing CXCR4 expression in positive cells, blue fluorescence microscopy (C) showing Hoechst 33258 stained nuclei, and merged A, B and C (D)

圖 3 Wallerian變性神經(jīng)(右)與正常側(cè)神經(jīng)(左)對比Fig. 3 Nerves with Wallerianian degeneration(right) and normal nerves(left)

表1 平均光子強(qiáng)度Tab. 1 Average photon intensity in injured and normal nerves

圖 4 1 d、 3 d、 7 d、 14 d、 1個月、 2個月的RFP-BMSCs歸巢后坐骨神經(jīng)熒光成像圖，左側(cè)為正常對照側(cè)坐骨神經(jīng)，右側(cè)為切斷后坐骨神經(jīng)Fig. 4 Fluorescence imaging of normal sciatic nerve (left) and removed sciatic nerve (right) 1, 3, 7, 14 days, 1 and 2 months after homing of BMSCs

周圍神經(jīng)損傷后，與近端失去聯(lián)系的遠(yuǎn)端神經(jīng)發(fā)生Wallerian變性，髓鞘崩解，雪旺細(xì)胞增殖，并與巨噬細(xì)胞共同參與壞死髓鞘碎屑的清除，另外，發(fā)生Wallerian變性的神經(jīng)組織還釋放一系列化學(xué)物質(zhì)，如SDF-1、Fractalkine，動員外周血中和外源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向損傷部位遷移和聚集。作為一種理想且成熟的種子細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不僅能夠促進(jìn)軸突生長，還能夠分泌神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)支持軸突的延長[1-2]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，在心肌梗死、腦挫裂傷、脊髓損傷等模型中，通過靜脈移植或損傷組織周圍局部移植的間充質(zhì)干細(xì)胞均能夠遷移并聚集在損傷組織內(nèi)，參與損傷組織器官修復(fù)過程[3-6]。

圖 5 不同時間點(diǎn)A組(RFP-BMSCs+0.9%氯化鈉注射液)的光子強(qiáng)度比值(aP＜0.05, vs 1 d, bP＜0.01, vs 7 d)Fig. 5 Photon intensity ratio in group A at different time points(aP＜0.05, vs 1 d, bP＜0.01, vs 7 d)

圖 6 1 d和3 d， RFP-BMSCs+0.9%氯化鈉注射液組的平均光子強(qiáng)度比值高于RFP-BMSCs+AMD3100組(P＜0.05)Fig. 6 The average phonton intensity ratio is higher in group A than in group B (P＜0.05)

Fig. 7 Red fl uorescence microscopy showing RFP positive cells (A),and blue fluorescence microscopy showing Hoechst 33258 stained nuclei(B) and merged A and B (C)

本實(shí)驗(yàn)中，我們采用表達(dá)紅色熒光蛋白的RFP-BMSCs作為種子細(xì)胞，在SD大鼠周圍神經(jīng)損傷模型建立后的6個不同時間點(diǎn)，尾靜脈注射移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，然后采用小動物活體成像系統(tǒng)觀察RFP-BMSCs在損傷的周圍神經(jīng)段中的聚集情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，周圍神經(jīng)損傷后，6個不同時間點(diǎn)通過血管途徑移植的RFP-BMSCs均成功遷移到了損傷部位，且RFP-BMSCs在損傷段中的聚集呈現(xiàn)先增高后降低的現(xiàn)象，在神經(jīng)損傷后的第7天達(dá)到峰值。所以，實(shí)驗(yàn)提示我們在通過靜脈移植干細(xì)胞治療周圍神經(jīng)損傷時，可能存在最佳的治療時間點(diǎn)。

Ji等[11]發(fā)現(xiàn)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞可以表達(dá)CXCR4(SDF-1的特異性受體)、CX3CR1(Fractalkine特異性受體)、CCR2、CCR5四種受體，且證實(shí)了腦室內(nèi)局部注射SDF-1可以誘導(dǎo)干細(xì)胞向損傷的舌下神經(jīng)節(jié)內(nèi)遷移。間充質(zhì)干細(xì)胞向損傷的周圍神經(jīng)遷移和聚集，其本質(zhì)是一種趨化現(xiàn)象，可能通過SDF-1-CXCR4、Fractalkine-CX3CR1等細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)。作為細(xì)胞表面蛋白CXCR4的特異性阻斷劑AMD3100可以阻止SDF-1與CXCR4的結(jié)合，從而在周圍神經(jīng)損傷中抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向損傷部位遷徙[8-9]。本實(shí)驗(yàn)中A組作為實(shí)驗(yàn)組，尾靜脈注射RFP-BMSCs和0.9%氯化鈉注射液，B組作為條件對照組，尾靜脈注射RFPBMSCs和AMD3100。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在坐骨神經(jīng)損傷的早期(1 ～ 3 d)，A組(RFP-BMSCs+0.9%氯化鈉注射液)的平均光子強(qiáng)度比值高于B組(RFP-BMSCs+AMD3100)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在坐骨神經(jīng)損傷的中晚期(3 d ～2個月)，盡管注射了AMD3100，間充質(zhì)干細(xì)胞也可以向損傷遷移。因此，我們認(rèn)為，神經(jīng)損傷后可能釋放多種細(xì)胞因子，如SDF-1、Fractalkine等，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢，但是SDF-1可能只參與周圍神經(jīng)損傷后早期的干細(xì)胞歸巢，至于中晚期干細(xì)胞歸巢的實(shí)現(xiàn)，可能是由于其他細(xì)胞因子的參與。因此，對于陳舊性神經(jīng)損傷的病例，我們可以嘗試通過在損傷神經(jīng)周圍或神經(jīng)內(nèi)添加趨化因子(SDF-1、Fractalkine等)促進(jìn)干細(xì)胞的歸巢以提高神經(jīng)修復(fù)效果。

綜上所述，RFP-BMSCs在損傷的周圍神經(jīng)中存在歸巢現(xiàn)象，并且在損傷后的不同時間呈現(xiàn)先增高后降低的歸巢現(xiàn)象；RFP-BMSCs的歸巢現(xiàn)象可能受到SDF-1-CXCR4軸的調(diào)控，可以被CXCR4特異性拮抗劑AMD3100所抑制。

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Chemotaxis of peripheral nerve Wallerianian degeneration at different time points on homing of stem cells

GAO Xu-peng, PENG Jiang, SUN Xun, GUO Zhi-yuan, WANG Yu, LU Shi-bi, ZHAO Qing Institute of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
Corresponding Author: PENG Jiang. Email: pengjiang301@126.com

ObjectiveTo observe the effect of peripheral nerve Wallerianian degeneration at different time points on homing of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs).MethodsSeventy-two adult male SD rats weighing 220-250 g were randomly divided into 6 groups (n=12) according to their weight. Each group was divided into group A and group B according to the injected cells and drugs. Rats in group A (n=6) were injected with BMSCs and saline via their tail vein and those in group B (n=6) were injected with BMSCs and AMD3100. Their sciatic nerve was cut off along the inferior border of piriformis under aseptic condition with its proximal end ligated and distal end excluded. The rats in group A were injected with BMSCs and saline 1, 3, 7, 14 days, 1 and 2 months after sciatic nerve transaction and those in group B were injected with BMSCs and AMD3100. Three days after injection,the effect of peripheral nerve Wallerianian degeneration on homing of BMSCs was observed through the in vivo imaging system.Results The aggregation of BMSCs in sciatic nerve with Wallerianian degeneration increased at fi rst and then decreased with the prolonged time, and was weaker in group B than in group A during the early Wallerianian degeneration of sciatic nerve (1-3 d).Conclusion BMSCs can migrate into the peripheral nerve tissue with Wallerianian degeneration. Their homing increases at fi rst and then decreases with time, which is regulated by the SDF-1-CXCR4 axis and inhibited by the CXCR4 speci fi c antagonist AMD3100.

bone marrow mesenchymal stem cells; peripheral nerve injury; stem cells homing

R 319

A

2095-5227(2014)05-0458-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.05.017

時間：2014-04-01 17:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140401.1738.002.html

2013-11-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170946)；國家“863”主題項(xiàng)目(2012AA020502)；全軍十二五重點(diǎn)項(xiàng)目(BWS11J025)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(31170946);'863' Program of China(2012AA020502); Military Special-purpose Program of "Twelfth Five-Year"(BWS11J025)

高旭鵬，男，在讀碩士，醫(yī)師。研究方向：周圍神經(jīng)創(chuàng)傷與修復(fù)。Email: gysgxp@126.com

彭江，男，副主任醫(yī)師，副教授。Email: pengjiang301@126.com