華 川，曹海濤

腸易激綜合征(IBS)被認為與腸道微生態(tài)環(huán)境的變化有關(guān)。正常的腸道菌群在長期歷史進化過程中形成了一個動態(tài)的微生態(tài)系統(tǒng)，像一道“屏障”保護宿主的健康，維持人體腸道正常生理功能。兒童腸道菌群的定植時間較成人短，更易受到外界的影響而發(fā)生改變，外來細菌容易入侵，從而影響腸道菌群中的細菌比例，引起消化不良、腹瀉［1-2］。本研究采用SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR法分析25例IBS兒童腸道菌群的變化，并與健康兒童進行對比，現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 對象分組與標本采集 采用無菌采便盒采集2012年6—10月解放軍252醫(yī)院1～6歲符合羅馬Ⅲ診斷標準［3］的住院IBS患兒25例(IBS患兒組)及同期門診健康體檢兒童25例(健康對照組)的糞標本［4］。所有患者留取糞標本前均未應(yīng)用抗生素或微生態(tài)制劑;對照組兒童留取糞標本前2周內(nèi)無消化道不適癥狀。兩組年齡、性別等一般資料差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 主要儀器和試劑 糞便基因組DNA提取試劑盒、SYBR Green熒光染料均購自北京天根生化科技有限公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA Marker、瓊脂糖、2 ×PCR Mix購自北京康為世紀生物科技有限公司，實驗所需引物為北京天一輝遠生物科技有限公司(合成，PCR儀為美國伯樂公司的MyCycler，熒光定量PCR儀為美國ABI 7500)。

1.3 方法

1.3.1 糞標本細菌DNA的抽提:取2 g糞便加入18 ml無菌PBS，振蕩10 min形成糞漿，取0.2 g用DNA緩沖液處理，取上清200 μl使用天根糞便基因組DNA提取試劑盒(DP328)抽提糞樣品內(nèi)的細菌基因組DNA，操作依照說明書進行。

1.3.2 PCR引物的設(shè)計:根據(jù)雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、腸球菌、擬桿菌屬、梭桿菌屬、梭菌屬16SrDNA基因序列，應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer premier 5.0設(shè)計并參考文獻［5］，定PCR引物(表1)。

表1 16SrDNA基因PCR擴增引物序列

1.3.3 制作標準曲線:取標準菌株凍干粉各0.2 g，用1 ml PBS溶解，其中200 μl用于試劑盒提取標準菌株基因組DNA，并用相應(yīng)的引物擴增。將擴增產(chǎn)物用DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化，將標準菌株的DNA測量OD值，計算雙鏈DNA的濃度，計算出PCR片段的拷貝數(shù)換算為各標準品1 μl的拷貝數(shù):雙歧桿菌屬2.3×1014，乳酸桿菌屬1.8×1014，大腸桿菌屬5.8×1014，糞腸球菌2.6×1014，屎腸球菌3.6×1014，擬桿菌屬3.95×1014，梭桿菌屬5.16×1014，梭菌屬2.02×1014，然后行10倍系列稀釋，使之成為1×102～1×108拷貝數(shù)/ml，作為標品，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，得到標準曲線，其中橫坐標代表不同陽性模板細菌拷貝數(shù)(N)的對數(shù)值(LogN)，縱坐標代表出現(xiàn)熒光信號的初始循環(huán)數(shù)(Ct值)。

1.3.4 熒光定量PCR:采用20 μl反應(yīng)體系:SYBR premix(2 × )9 μl，10 μmol/L 上下游引物各 1 μl，模板 2 μl，水 7 μl，最后加入液狀石蠟 8 μl，擴增條件為 95℃ 預(yù)變性 2 min，95℃ 變性 20 s，雙歧桿菌57℃、擬桿菌屬 57℃、乳酸桿菌 58℃、梭桿菌屬58℃、大腸桿菌59℃、梭菌屬59℃、糞腸球菌60℃、屎腸球菌61℃退火30 s，68℃延伸30 s，循環(huán)40次，74℃后延伸1 min。每次反應(yīng)每個樣品做一個復孔，并做陽性和陰性對照。反應(yīng)完畢根據(jù)熔解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性。最后根據(jù)標準曲線和樣品的Ct值，得出樣品中7種細菌的拷貝數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，菌群所測結(jié)果行對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示，組間差異采用兩獨立樣本t檢驗，α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 總DNA提取結(jié)果 兩組糞便標本提取總DNA后，1%瓊脂糖凝膠電泳，80 V恒壓30 min后在凝膠成像儀成像，濃度及純度可以作為PCR后續(xù)使用。部分DNA凝膠電泳結(jié)果見圖1。

圖1 糞便標本DNA電泳圖

2.2 細菌定量檢測結(jié)果 與健康對照組比較，IBS患兒組糞標本中的雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、梭桿菌屬和梭菌屬數(shù)量明顯減少(P＜0.05)，大腸桿菌、腸球菌屬和擬桿菌屬數(shù)量無明顯變化(P＞0.05)，見表2。

表2 兩組糞標本細菌定量檢測結(jié)果(± s，LogN/g)

表2 兩組糞標本細菌定量檢測結(jié)果(± s，LogN/g)

注:IBS為腸易激綜合征;aP＜0.05

患兒組雙歧桿菌屬 8.85±0.57 8.28±0.68細菌 健康對照組 IBS a乳酸桿菌屬 8.36±0.45 7.79±0.39a大腸桿菌 8.41±0.38 8.40±0.50腸球菌屬 7.49±0.65 7.56±0.42擬桿菌屬 10.62±0.47 10.64±0.55梭桿菌屬 8.12±0.44 6.07±0.46a梭菌屬 7.32±0.63 6.66±0.65a

3 討論

腸道微生態(tài)系統(tǒng)是機體最龐大、最重要的微生態(tài)系統(tǒng)。人體腸道內(nèi)的微生物中，超過99%均是細菌，存活細菌數(shù)量大約有100兆個，有500～1000個不同的種類。這些數(shù)目龐大的細菌大致可以分為三大類:有益菌、有害菌和中性菌。人體是否健康與腸道內(nèi)的益生菌群結(jié)構(gòu)息息相關(guān)。腸道菌群在長期的進化過程中，通過個體的適應(yīng)和自然選擇，菌群中不同種類之間，菌群與宿主之間，菌群、宿主與環(huán)境之間，始終處于動態(tài)平衡狀態(tài)中，形成一個互相依存、互相制約的系統(tǒng)，因此，人體在正常情況下，菌群結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，對宿主表現(xiàn)為不致?。?-7］。IBS是最常見的功能性腸胃病，腸道菌群失調(diào)在IBS發(fā)病過程中的作用已經(jīng)被廣泛認同［8-10］。通常研究的腸道菌群主要有大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌4個種群，本研究另加入和腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)的厚壁菌門和擬桿菌，梭菌屬是厚壁菌門的優(yōu)勢菌屬，梭菌屬結(jié)構(gòu)的變化與腸道黏膜的黏膜完整性密切相關(guān)［11］，其中的產(chǎn)氣莢膜梭菌具有編碼腸毒素和細胞毒素的致病基因，其毒素可以破壞腸黏膜而引發(fā)腹瀉等疾病，另一方面酪酸梭菌產(chǎn)生的丁酸鹽則可保證黏膜的完整性，起到保護腸道、抵御結(jié)腸癌的作用，酪酸梭菌還能與雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌共生并促進其增殖，加強腸道的蠕動，減少機會致病菌在腸腔內(nèi)停留時間，從而減少病菌黏附和定植［12］。擬桿菌是腸道菌群的三大菌屬之一，也是腸道中最主要的厭氧菌，在幫助宿主分解多糖、促進腸黏膜的血管再生和免疫系統(tǒng)的發(fā)育方面有重要作用，有利于維持腸道微生態(tài)的平衡，梭桿菌屬和擬桿菌屬是擬桿菌科中最重要的組成部分［13-15］。

人出生后數(shù)小時胃腸道就會有細菌出現(xiàn)，即菌群初級演替，此后經(jīng)生理演替和刺激演替達到穩(wěn)態(tài)，至斷乳后腸道菌群結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，整個兒童期維持這種狀態(tài)。由于兒童期仍處于次級演替過程，其腸道內(nèi)生環(huán)境、定植能力及免疫功能尚不穩(wěn)定，故腸道微生態(tài)的平衡穩(wěn)定性較差，容易受到氣候、飲食等因素的影響［16-17］。

16SrDNA是細菌染色體上的一段被用于細菌分類的DNA序列，其保守區(qū)在進化過程中穩(wěn)定，某些序列片段為所有細菌所共有，中間的可變區(qū)則與種屬相關(guān)。根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中已知的不同細菌的16SrDNA序列設(shè)計特異性引物，就可應(yīng)用實時定量PCR技術(shù)檢測樣本中細菌中對應(yīng)的拷貝數(shù)。實時熒光定量PCR技術(shù)實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，以特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點成為分子生物學研究中的重要工具。擴增序列非特異性檢測方法的基礎(chǔ)是DNA結(jié)合的熒光分子，如SYBR Green I等熒光染料。在PCR反應(yīng)體系中加入過量SYBR Green I熒光染料，熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈中后，發(fā)射熒光信號。熒光染料的優(yōu)勢在于其能檢測任何dsDNA序列的擴增，不需要探針的設(shè)計，使檢測方法變得簡便，同時也降低了檢測的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，因此其也能與非特異性的dsDNA如引物二聚體結(jié)合，使實驗容易產(chǎn)生假陽性信號。引物二聚體的問題目前可以通過熔解曲線來解決［18-19］:熔解曲線如果為單峰，則表示引物特異，無引物二聚體，則實驗結(jié)果可信。

本實驗所研究的對象為菌屬，其類型較多，并且無法設(shè)計合適的探針，所以選擇設(shè)計特異的菌屬引物，使用SYBR Green I嵌合熒光法進行熒光定量PCR，其原理是通過PCR反應(yīng)生產(chǎn)雙鏈DNA，SYBR Green I與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出熒光，通過PCR反應(yīng)液中的熒光信號強度，可以對目的基因進行準確定量。在本實驗中，各個樣本都進行3次重復試驗，每次所得結(jié)果取均數(shù)基本一致，這也證實了本研究選取的方法具有穩(wěn)定性和可重復性。本研究應(yīng)用SYBR GreenI實時熒光定量PCR技術(shù)，實現(xiàn)了對雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬等難培養(yǎng)的腸道細菌的定量分析，結(jié)果顯示，IBS患兒組與健康對照組4種細菌數(shù)量的差異有統(tǒng)計學意義，提示腸道菌群的變化與兒童IBS的發(fā)生及發(fā)展機制有一定的關(guān)系。SYBR GreenI實時熒光定量PCR技術(shù)為兒童腸道菌群組成、動態(tài)變化及相關(guān)研究提供了一種有效監(jiān)測手段，為臨床診治提供新的理論依據(jù)。

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