馬珊珊，劉 靜，姚 寧，崔淵博，邢 衢，王夢然，郭天宇，楊 波，關(guān)方霞1，

1)鄭州大學生命科學學院干細胞實驗室 鄭州 450001 2)華東師范大學生命科學學院 上海 200241 3)中山大學生命科學學院 廣州 510275 4)鄭州大學第一附屬醫(yī)院 鄭州 450052

衰老是機體的細胞、組織及器官在結(jié)構(gòu)和功能上逐漸出現(xiàn)的不可逆轉(zhuǎn)的全面退行性變化。目前研究[1]認為，衰老是干細胞衰退、DNA退化、飲食及精神因素、衰老基因活躍等綜合作用的結(jié)果，但仍未形成統(tǒng)一的衰老理論。細胞衰老是受某些基因控制、借助于信號轉(zhuǎn)導途徑實現(xiàn)的，其中P16/Rb和P53控制的信號途徑至關(guān)重要[2-4]。研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，在衰老細胞中p16基因處于高表達水平。該研究首先構(gòu)建p16基因高表達載體，然后將高表達載體轉(zhuǎn)染293細胞，并觀察p16基因高表達對293細胞增殖、細胞周期及衰老的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞 293細胞為鄭州大學生命科學學院干細胞實驗室保存的人腎上皮細胞，用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)傳代。

1.2 主要試劑 Trizol和Lipofectamine2000均購自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和β-半乳糖苷酶染色試劑盒均購自TaKaRa公司，Western blot相關(guān)試劑和抗體均購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.3 p16基因高表達載體的構(gòu)建 取對數(shù)生長期的293細胞，消化后離心，收集細胞，用Trizol提取細胞總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA模板。根據(jù)p16 mRNA序列(GenBank登錄號為:U26727.1)設計引物，RT-PCR擴增p16基因ORF序列(上游引物為5'-GCCGGAAGCTTATG GTGCGCAGGTTCTTGGT-3'，下游引物為 5'-CTAAT GGTACCCAGCCAGGTCCACGGGCAGA-3'，下劃線堿基表示引入的酶切位點)。反應條件為:95℃預變性5 min;95℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán);72℃延伸5 min，4℃終止反應。然后將擴增片段酶切后插入到pEGFP-N1的HindⅢ和KpnⅠ位點之間，構(gòu)成重組質(zhì)粒 pEGFPN1-p16ORF。

1.4 p16基因高表達載體轉(zhuǎn)染293細胞 用Lipofectamine2000將p16基因高表達載體轉(zhuǎn)染293細胞，操作步驟嚴格按照說明書進行。將293細胞分為3組:正常組、空質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染pEGFP-N1)、高表達組(轉(zhuǎn)染pEGFPN1-p16ORF)，每組3個復孔。各組細胞均置于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h之后在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況。

1.5 CCK-8法檢測p16基因高表達對293細胞增殖的影響 細胞分組及處理同1.4。各組細胞每天同一時間加入10 μL CKK-8溶液，于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，檢測細胞在450 nm波長下的吸光度值，連續(xù)測6 d，記錄數(shù)據(jù)，繪制細胞生長曲線。

1.6 PI染色法檢測p16基因高表達對293細胞周期的影響 細胞分組及處理同1.4。培養(yǎng)24 h后消化、收集各組細胞并計數(shù)，調(diào)整細胞密度為2×106mL－1。取1 mL單細胞懸液，離心后去除上清，在細胞中加入2 mL體積分數(shù)為70%的冰乙醇固定過夜。用PBS洗去固定液，加入2.5 μL 10 g/L RNase A并置于37℃水浴30 min。避光加入PI染料，4℃30 min。上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.7 RT-PCR法檢測各組293細胞中p16和p21 mRNA的表達 細胞分組及處理同1.4。首先采用Trizol法抽提各組細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用RT-PCR試劑盒并按說明進行操作，采用β-actin作為內(nèi)參。引物序列見表1。反應條件:95℃30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用比較CT法，mRNA相對表達量=2－ΔΔCT。

表1 引物序列

1.8 Western blot法檢測各組293細胞中P16和P21蛋白的表達 細胞分組及處理同1.4。收集3組細胞，提取總蛋白。加入適量蛋白抽提試劑，冰上孵育30 min，讓細胞充分裂解。蛋白樣品中加入5×上樣緩沖液，沸水中煮10 min，再迅速冰浴5 min，分裝后置于－20℃保存?zhèn)溆谩＝?jīng)SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜后于體積分數(shù)5%的脫脂牛奶中室溫封閉1 h，加入鼠抗 P16一抗(1∶500稀釋)、P21一抗(1∶1000稀釋)過夜孵育，TBST洗膜3次，用辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠二抗在室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL化學發(fā)光顯影成像，最后用Image J圖像分析軟件進行蛋白灰度分析。

1.9 各組293細胞β-半乳糖苷酶表達的檢測 細胞分組及處理同1.4。吸取各組細胞培養(yǎng)液，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定10 min。去除細胞固定液，用PBS洗滌細胞3次，每次3 min。然后每孔加入1 mL染色工作液，37℃孵育2 h。普通光學顯微鏡下觀察，藍染細胞為衰老細胞。100倍鏡下選取5個視野，觀察并計算陽性細胞百分率。

1.10 統(tǒng)計學處理 采用 SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析。3組間細胞周期分布、p16及p21 mRNA和蛋白相對表達量、β-半乳糖苷酶陽性細胞率的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準 α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 p16基因高表達載體轉(zhuǎn)染293細胞 結(jié)果見圖1。

2.2 p16基因高表達對293細胞增殖的影響 各組293細胞生長曲線見圖2。

2.3 p16基因高表達對293細胞周期的影響 結(jié)果見表2。高表達組G0/G1期細胞增加，S期、G2/M期細胞減少。

圖1 各組293細胞GFP的表達(×100)

圖2 各組293細胞的生長曲線

表2 各組293細胞周期的變化 %

2.4 RT-PCR檢測各組293細胞中 p16和 p21 mRNA的表達 結(jié)果見表3。可知高表達組中p16和p21 mRNA的表達上升。

2.5 Western blot檢測各組293細胞中P16和P21蛋白的表達 結(jié)果見圖3和表4?？芍?，高表達組P16和P21蛋白的表達上升。

2.6 各組293細胞中β-半乳糖苷酶表達的檢測高表達組293細胞β-半乳糖苷酶的表達上升(圖4和表5)。

表3 各組293細胞中p16、p21 mRNA的表達

圖3 各組293細胞中P16和P21蛋白的表達

表4 各組293細胞中P16、P21蛋白的表達

圖4 各組293細胞β-半乳糖苷酶染色情況(×40)

表5 各組293細胞β-半乳糖苷酶陽性細胞率 %

3 討論

Han等[7]研究發(fā)現(xiàn)P16蛋白能增加P21蛋白的穩(wěn)定性，P21蛋白則通過轉(zhuǎn)錄因子Sp1激活p16基因的表達，二者協(xié)同抑制細胞周期。細胞周期的停滯是細胞衰老的前提，細胞衰老伴隨著細胞形態(tài)的改變和相關(guān)基因表達的變化[6，8-10]。研究[11]表明利用脂質(zhì)體介導p16 cDNA真核表達載體轉(zhuǎn)入p16陰性的人紅白血病細胞株后，細胞增殖受到抑制，凋亡率增加。該實驗將p16基因高表達載體轉(zhuǎn)染至293細胞，結(jié)果顯示p16基因高表達抑制了293細胞的增殖并將細胞阻滯在G0/G1期，而且p16基因高表達可以上調(diào)細胞衰老相關(guān)基因 p21的表達，說明p16基因可能通過促進p21基因的表達導致細胞衰老。

細胞衰老的指標中，除p21表達升高外，β-半乳糖苷酶的表達亦升高。有研究[12]發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的人二倍體成纖維細胞在pH為6時，其β-半乳糖苷酶陽性率隨著代齡增加而增加，因此β-半乳糖苷酶是目前公認的檢測細胞衰老的金標準。該實驗中作者發(fā)現(xiàn)p16基因高表達載體導致293細胞中β-半乳糖苷酶陽性細胞率上升，說明細胞已呈現(xiàn)衰老狀況。

總之，該研究說明p16基因在細胞衰老過程中發(fā)揮調(diào)控作用，并初步建立了p16基因高表達的細胞衰老模型，為進一步研究細胞衰老的機制奠定了基礎。

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