束雙雙，張連云，黃艷梅，張 晶，楊保勝，咸 韋

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)物證學(xué)教研室 新鄉(xiāng)453003 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科 新鄉(xiāng)453003 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院腎內(nèi)科新鄉(xiāng)453003

Alport 綜合征(Alport syndrome，AS)又稱遺傳性腎炎，是一種主要累及腎臟的遺傳病。臨床上AS主要表現(xiàn)為患者反復(fù)血尿、蛋白尿以及進(jìn)行性腎功能衰退，可伴有眼部疾病和感音神經(jīng)性耳聾等腎外表現(xiàn)。目前認(rèn)為AS 的發(fā)病機(jī)制與編碼腎小球基底膜上Ⅳ型膠原α3、α4 和α5 鏈的基因突變有關(guān)，且具有遺傳異質(zhì)性。其中，編碼α5 鏈的COL4A5 基因突變可導(dǎo)致性連鎖AS(XLAS，約占85%);編碼α3和α4 鏈的COL4A3 及COL4A4 基因突變可導(dǎo)致常染色體隱性AS(ARAS，約占14%)和常染色體顯性AS(ADAS，約占1%)［1-2］。國(guó)內(nèi)關(guān)于ADAS 相關(guān)基因突變的報(bào)道較少。該研究對(duì)一ADAS 家系的COL4A3/COL4A4 基因突變進(jìn)行了分析。

1 對(duì)象與方法

1．1 研究對(duì)象 先證者(Ⅲ5)，男，21歲，聽力下降6 a 余，以“顏面浮腫半個(gè)月”為主訴入院，半個(gè)月前受涼后出現(xiàn)咳嗽、咳痰。檢查示，尿紅細(xì)胞90～100/HP，異性紅細(xì)胞比例＞60%，為腎小球源性血尿;24 h 尿蛋白定量5 g。血肌酐146 μmol/L，尿素氮8．64 mmol/L。彩超示雙腎彌漫性損傷。電測(cè)聽檢查雙耳為中度神經(jīng)性耳聾。腎活檢病理組織學(xué)檢查示腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)輕至中度彌漫性增生，腎小管上皮細(xì)胞灶狀萎縮，腎間質(zhì)多灶狀淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)伴纖維化。電鏡下可見GBM 不規(guī)則增厚，節(jié)段GBM 變薄，致密層分裂，伴不規(guī)則內(nèi)外側(cè)緣，呈“花籃狀”改變，其中可見“電子致密顆?！薄ＤI活檢組織(圖1)Ⅳ型膠原抗α3、α4 羥基端非膠原區(qū)抗體免疫熒光染色為陰性。該患者AS 診斷明確。

圖1 正常人(A)及先證者(B)腎臟基底膜Ⅳ型膠原α 鏈(免疫熒光，×400)

1．2 家系調(diào)查 對(duì)該家系成員進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括年齡、性別、腎功能指標(biāo)以及聽覺和視覺，繪制系譜圖(圖2)。該家系無近親結(jié)婚史，根據(jù)系譜分析符合常染色體顯性遺傳。在該家系成員中，Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ5 有不同程度的鏡下血尿，均為腎小球源性。Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ5 出現(xiàn)蛋白尿;Ⅱ7、Ⅲ3 有輕度的神經(jīng)性耳聾，先證者Ⅲ5 出現(xiàn)了腎功能衰竭，Ⅱ7、Ⅲ3 處于腎功能代償期(表1)。Ⅰ1 50歲、Ⅱ3 38歲因腎功能衰竭死亡，Ⅱ1 及Ⅱ4 均有長(zhǎng)期血尿史。

圖2 一ADAs 家系系譜圖

表1 一ADAs 家系臨床資料

1．3 全基因組DNA 的提取 知情同意后，采集河南漢族一常染色體顯性遺傳Alport 綜合征家系成員12 人外周靜脈血，其中男7 人(Ⅱ5、Ⅱ7、Ⅲ1、Ⅲ4、Ⅲ5、Ⅲ6、Ⅳ2)，女5 人(Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅲ2、Ⅲ3、Ⅳ1)。另取50 名健康人外周靜脈血作為對(duì)照。所有血樣本采用有機(jī)酚-氯仿法提取基因組DNA。

1．4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序參照文獻(xiàn)［3-4］，根 據(jù)COL4A3/COL4A4 基因各外顯子臨近區(qū)域的內(nèi)含子序列，合成上、下游引物序列。擴(kuò)增體系25 μL，其中含10 ×Buffer 2．5 μL，2．0 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L 正反引物各1 μL，DNA Taq 酶1 U，100 mg/L DNA 模版3 μL，ddH2O 16．1 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min;94℃變性45 s，退火45 s，72℃延伸45 s，32個(gè)循環(huán);72℃再延伸10 min。擴(kuò)增后經(jīng)60 g/L 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，由美國(guó)Invitrogen 公司進(jìn)行雙向測(cè)序。分析測(cè)序結(jié)果并與健康人及GenBank 中序列進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

對(duì)先證者及該家系中患病者COL4A3/COL4A4基因外顯子進(jìn)行測(cè)序，并與50 名健康人測(cè)序結(jié)果及GenBank 序列進(jìn)行對(duì)比分析，共篩選出COL4A3/COL4A4 基因8個(gè)突變位點(diǎn)，其中包括1個(gè)錯(cuò)義突變、1個(gè)內(nèi)含子突變和6個(gè)序列變異。見表2、圖3。

圖3 COL4A3/COL4A4 基因測(cè)序結(jié)果

COL4A4 基因第44 外顯子的錯(cuò)義突變c．4195 A ＞T 導(dǎo)致M1399L，該家系有癥狀的患者(Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ5)均出現(xiàn)了此突變，均表現(xiàn)為雜合子，而作為對(duì)照的50 名健康人以及該家系表現(xiàn)正常者中未出現(xiàn)此突變。先證者Ⅲ5 第44 內(nèi)含子上出現(xiàn)c．4127+11 C ＞T 突變，其他家系成員未見此突變。

3 討論

ADAS 通常是由COL4A3 和(或)COL4A4 基因突變引起，這些基因定位于2q35～q37，分別編碼構(gòu)成Ⅳ型膠原的α3 及α4 鏈。COL4A3 及COL4A4 基因突變可導(dǎo)致α3 及α4 鏈的異常，引起Ⅳ型膠原分子結(jié)構(gòu)的改變和功能的缺陷，進(jìn)而影響腎臟基底膜的正常網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［5］。目前25%～50% AS 的突變?yōu)楦拾彼崛〈蛔?，甘氨酸被認(rèn)為是最小的氨基酸，可以插入Ⅳ型膠原緊密的三螺旋內(nèi)部，它的取代突變可破壞螺旋的形成，進(jìn)而影響基底膜的結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致疾病。ADAS 的常見突變包括甘氨酸取代突變、錯(cuò)義突變、剪接位點(diǎn)突變等，但無明顯的突變熱點(diǎn)［6］。

該研究發(fā)現(xiàn)位于COL4A4 基因第44 外顯子上的錯(cuò)義突變c．4195 A ＞T，導(dǎo)致α4 鏈第1 399個(gè)氨基酸由甲硫氨酸替換為亮氨酸(M1399L)，該突變尚未見報(bào)道。該家系中凡是有血尿、蛋白尿的患者均出現(xiàn)此突變，表現(xiàn)為雜合子。先證者的母親(Ⅱ2)無臨床表現(xiàn)，基因檢測(cè)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)異常，50 名健康人也未檢測(cè)到此突變。推測(cè)此突變可能為該家系的致病突變位點(diǎn)，這與文獻(xiàn)［7］報(bào)道的常見的甘氨酸取代突變有所不同。該突變可能影響了膠原鏈的組裝，但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

該家系中亦發(fā)現(xiàn)了一個(gè)尚未報(bào)道的內(nèi)含子突變c．4127 +11 C ＞T，該突變僅出現(xiàn)于先證者COL4A4基因上，先證者在該家系存活者中病情最嚴(yán)重，已出現(xiàn)腎功能衰竭。由于該突變未出現(xiàn)在剪接位點(diǎn)，先證者病情嚴(yán)重程度是否與該突變有關(guān)尚不清楚。該研究中作者發(fā)現(xiàn)COL4A3/COL4A4 基因上有3個(gè)同義突變和3個(gè)錯(cuò)義突變。文獻(xiàn)［8-10］報(bào)道以上6個(gè)序列變異為多態(tài)性位點(diǎn)，這些基因的多態(tài)性是否也導(dǎo)致了Ⅳ膠原鏈形成的異常并引起AS 還有待于進(jìn)一步研究。

研究［11］表明ADAS 具有遺傳多源性。該家系中同樣具有雜合突變的Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ5，其臨床表現(xiàn)嚴(yán)重程度不一，蛋白尿、血尿的程度不一，表型和基因型的關(guān)系不明確，推測(cè)可能與其他染色體上的基因突變有關(guān)，需進(jìn)一步研究。

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