呂瑞濤，法憲恩，朱方濤，黃真鋒，高 勇，趙建明

鄭州大學第二附屬醫(yī)院心血管外科 鄭州 450014

缺血性心臟病對人類健康的危害程度越來越大。經(jīng)過溶栓、支架植入、冠狀動脈旁路移植術(shù)等方法治療后，缺血心肌組織的血供得以恢復，但由于心肌缺血再灌注損傷的存在，患者的病情恢復受到了嚴重制約。有研究[1]表明，二氧化鈰(CeO2)納米顆粒可以清除氧自由基，具有抗氧化應激的能力。心肌缺血再灌注損傷的主要原因即是氧自由基的大量產(chǎn)生。該研究旨在觀察CeO2納米顆粒對缺血再灌注損傷大鼠心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK－MB)水平的影響，進而分析CeO2納米顆粒對大鼠缺血再灌注損傷心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 250～300 g健康成年雄性SD大鼠24只，購于河南省實驗動物中心;10～25 nm粒徑CeO2納米顆粒，購于美國Sigma公司，批號554841;SOD、MDA、CAT、LDH、CK－MB 檢測試劑盒，購于南京建成生物工程研究所;HX－100E型MS4000小動物呼吸機，購于成都泰盟科技有限公司;VCX500型超聲細胞破碎儀，購于美國Sonics公司;DG5031型酶聯(lián)免疫檢測儀，購于華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司。

1.2 實驗分組 將24只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為3組，模型組、假手術(shù)組、CeO2納米顆粒組，每組8只。適應性飼養(yǎng)1周后進行模型的制作。模型組于模型制作前24 h經(jīng)大鼠尾靜脈注射PBS液(2 mL/kg)，然后成功制作心肌缺血再灌注模型;假手術(shù)組于術(shù)前24 h經(jīng)尾靜脈注射PBS液(2 mL/kg)，左冠狀動脈前降支只穿線不結(jié)扎;CeO2納米顆粒組于術(shù)前24 h經(jīng)尾靜脈注射CeO2納米顆粒懸液(2 mL/kg)，模型制作同模型組。

1.3 大鼠心肌缺血再灌注模型制作 將大鼠采用腹腔注射體積分數(shù)10%水合氯醛的方法麻醉，仰臥位固定并行氣管插管，連接小動物呼吸機。呼吸機潮氣量設(shè)置為30 mL/kg，70次/min，吸呼比2∶1。于胸骨左緣第4、5肋間心臟搏動最明顯處切開皮膚，分離組織進入胸腔。撕破心包膜，將心臟充分暴露。在肺動脈圓錐與左心耳之間距離主動脈根部約3 mm處穿線，在線結(jié)和心臟表面墊一乳膠管，待大鼠心律規(guī)整后結(jié)扎左冠狀動脈前降支。結(jié)扎線遠端心肌顏色先變白而后變紫紺為結(jié)扎成功，結(jié)扎45 min后松解結(jié)扎線，再灌注120 min，缺血心肌組織顏色恢復為模型制作成功。

1.4 CeO2納米顆粒懸液制備 將CeO2納米顆粒溶于PBS液中，使其充分溶解，制成1000 mg/L的納米懸液。用前在超聲細胞破碎儀中振蕩2 min，充分混勻，并用0.2 μm針頭濾器過濾。

1.5 心肌組織病理學觀察和心肌酶學檢測 再灌注120 min后松解結(jié)扎線，處死大鼠并快速取出心臟，取左心室缺血區(qū)心肌組織，使用預冷生理鹽水沖洗殘留血液，濾紙吸干心肌表面水分，將其分為2份，一份置于體積分數(shù)10%甲醛溶液中進行固定，制作石蠟切片，行HE染色，光鏡下觀察心肌組織病理學變化;另一份保存于－80℃冰箱用于SOD、CAT、LDH、CK－MB、MDA 的檢測，測定時將心肌組織在低溫環(huán)境下研磨成心肌組織勻漿，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析。各組間 SOD、CAT、LDH、CK－MB、MDA 的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD－t檢驗。檢驗水準 α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌組織 SOD、CAT、LDH、CK-MB活性和MDA含量測定結(jié)果 模型組與假手術(shù)組比較，心肌組織中 SOD、CAT、LDH、CK－MB 活性降低，MDA含量升高;CeO2納米顆粒組與模型組比較，SOD、CAT、LDH、CK－MB 活性升高，MDA 含量降低。見表 1、2。

表1 CeO2納米顆粒對心肌抗氧化酶的影響(n=8)

表2 CeO2納米顆粒對心肌損傷標志物和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的影響(n=8)

2.2 心肌組織病理學觀察結(jié)果 光鏡下可見，假手術(shù)組心肌細胞排列整齊，細胞膜結(jié)構(gòu)完整，未見炎性細胞浸潤現(xiàn)象;模型組可見心肌細胞腫脹、壞死，排列紊亂，伴有炎性細胞浸潤;CeO2納米顆粒組心肌細胞腫脹及壞死程度較模型組明顯減輕，炎性細胞浸潤減少。見圖1。

圖1 各組心肌組織HE染色結(jié)果(×200)

3 討論

心肌缺血再灌注損傷即是缺血心肌在恢復血液供應后，不僅不能完全恢復組織器官的功能，反而會出現(xiàn)心肌頓抑、再灌注性心律失常等較再灌注前更加嚴重的損傷的現(xiàn)象。心肌在正常情況下即能產(chǎn)生一定數(shù)量的氧自由基用于機體各種代謝需要。心臟針對氧自由基有其自身的清除機制，即內(nèi)源性氧自由基清除酶，主要有SOD、CAT、GSH－Px等。內(nèi)源性氧自由基清除酶與體內(nèi)的氧自由基之間保持著動態(tài)的平衡。

由冠狀動脈的阻塞或者閉鎖引起的心肌缺血，導致一系列復雜的細胞事件，引起心肌細胞的死亡。雖然再灌注后局部缺血組織的血供得到改善，但同時也會對心肌細胞產(chǎn)生損傷[2]。再灌注因為能導致心肌細胞腫脹、肌原纖維破壞、收縮帶形成和線粒體內(nèi)的鈣磷酸鹽沉積，故而可加速細胞壞死和對細胞膜的損傷。氧自由基對組織細胞的損害被認為是心肌缺血再灌注損傷的重要因素之一[3]。當心肌缺血再灌注發(fā)生時，氧自由基大量產(chǎn)生，如超氧陰離子、過氧亞硝酸鹽、羥自由基、一氧化氮、過氧化氫等，超出了自由基清除酶的清除能力。過多的氧自由基可以激發(fā)鏈式脂質(zhì)過氧化反應，造成細胞膜的損傷[4]。大量氧自由基與細胞膜和各種細胞器膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，生成MDA，從而影響細胞膜的完整性、流動性以及通透性。MDA作為氧自由基作用于胞膜不飽和脂肪酸所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，可間接反映心肌缺血再灌注損傷的程度[5]。LDH、CKMB主要存在于心肌細胞胞質(zhì)中，當胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，胞膜的完整性及通透性發(fā)生改變時，它們會從細胞內(nèi)大量釋放入血液中，故其可作為判斷心肌細胞受損程度的敏感指標[6]。SOD和CAT是體內(nèi)重要的抗氧化酶，具有清除氧自由基的作用，其活性可以反映機體清除氧自由基的能力。

我國的稀土儲存量和產(chǎn)量均位于世界首位，稀土納米材料的開發(fā)應用擴大了稀土的使用范圍。CeO2納米顆粒作為一種稀土材料，被廣泛用于催化、發(fā)光、儲氫、陶瓷等多個領(lǐng)域[7]。研究[8]表明，CeO2納米顆粒能夠通過弱化心肌細胞的氧化應激來改善心肌功能障礙;能夠保護胃腸皮層細胞避免放射引發(fā)的傷害，同時CeO2納米顆粒使組織中的活性氧產(chǎn)生減少，并提高SOD活性[9]。納米顆粒的生物學效應與其表面積大小密切相關(guān)，而隨著納米顆粒的減小，其表面積呈指數(shù)增加趨勢。納米顆粒的大小與其生物學效應有一定的相關(guān)性[10]。CeO2納米顆粒特殊的空間構(gòu)造使其具有特殊的生物學效應，同時存在的Ce3+和Ce4+在相互轉(zhuǎn)化的過程中能夠與組織中的氧自由基結(jié)合，減少氧自由基含量[1]。

在該研究中，模型組心肌組織由于脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的MDA含量顯著升高，LDH、CK－MB活性明顯降低，均表明了再灌注對心肌細胞膜的損傷。另外，內(nèi)源性抗氧化酶SOD、CAT的活性下降，進一步證實了模型組中氧化應激的發(fā)生。光鏡下可見模型組中心肌細胞腫脹及炎性細胞浸潤現(xiàn)象較假手術(shù)組嚴重，CeO2納米顆粒組較模型組上述現(xiàn)象明顯減輕。

該研究結(jié)果表明，CeO2納米顆粒能減輕大鼠缺血再灌注損傷心肌組織中的氧化應激，明顯提高再灌注損傷心肌組織中內(nèi)源性抗氧化酶SOD、CAT的活性和LDH、CK－MB的活性，降低MDA的含量，改善心肌細胞的組織學形態(tài)，對心肌細胞起到較好的保護作用。但其確切的作用機制及臨床應用的安全性方面仍然需要進行大量深入的研究。

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