常 佳，任景麗，楊鯤鵬，王立東

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科 鄭州 450014 3)河南省食管癌重點開放實驗室 鄭州 450052

食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)預(yù)后極差，病死率高，嚴重危害人類的生命與健康。ESCC的形成是一個多因素相互作用、多階段發(fā)展、多基因變異的復(fù)雜過程[1]，環(huán)境和遺傳因素的交互作用對食管癌的發(fā)生發(fā)展起重要作用[2]，其確切的發(fā)病機制仍不十分清楚。食管癌的治療現(xiàn)狀尚不十分樂觀，術(shù)前新輔助放化療不能明顯降低術(shù)后局部復(fù)發(fā)率[3]。轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a是一種重要的抑癌基因，在人體內(nèi)廣泛參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、凋亡、氧化應(yīng)激、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等過程，已成為腫瘤靶向治療研究的熱點之一[4]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)和細胞周期蛋白D1(CyclinD1)是原癌基因，參與多種腫瘤的形成。作者采用免疫組化方法檢測了ESCC和正常食管黏膜組織中FOXO3a、EGFR和CyclinD1的表達以及三者的關(guān)系，并分析它們與ESCC臨床病理特征的關(guān)系，以期為ESCC的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科2011年5月至2013年5月ESCC手術(shù)切除標本87例，每例標本于手術(shù)切除后取癌及正常食管黏膜組織(距原發(fā)性腫瘤邊緣5 cm以上)，常規(guī)制備蠟塊，均經(jīng)兩位病理科醫(yī)師證實為ESCC或正常食管黏膜組織。所有患者術(shù)前均未行放化療或其他抗腫瘤治療。87例患者中男57例，女30例;年齡46～81歲，其中＞60歲55例;組織學(xué)分級G1、G253例，G334例;腫瘤浸潤深度 T1、T256例，T3、T431例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例;依據(jù)TNM分期標準(UICC 2009版)，Ⅰ、Ⅱ期69例，Ⅲ、Ⅳ期18例。

1.2 ESCC及正常食管黏膜組織中3種蛋白的免疫組化檢測 FOXO3a兔抗人多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，EGFR鼠抗人單克隆抗體和CyclinD1兔抗人單克隆抗體購自基因科技(上海)有限公司，Envision試劑盒和DAB顯色試劑盒購自Dako公司。將制備的蠟塊連續(xù)4 μm厚切片，嚴格按照試劑說明書操作。FOXO3a抗體、EGFR抗體和CyclinD1抗體均按1∶100稀釋。用已知ESCC組織的陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 FOXO3a陽性染色主要定位于細胞核，EGFR定位于細胞膜和細胞質(zhì)，CyclinD1主要定位于細胞核，均表現(xiàn)為棕黃色或棕褐色顆粒。高倍鏡下選擇5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞。按染色深淺和陽性細胞百分比評定。染色深淺:無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;陽性細胞百分比:0為0分，～10%為1分，～50%為2分，～75%為3分，＞75%為4分。兩項評分的乘積≥4分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用配對χ2檢驗比較ESCC和正常食管黏膜組織中FOXO3a、EGFR、CyclinD1蛋白陽性表達率的差異;采用χ2檢驗比較ESCC組織中 FOXO3a、EGFR、CyclinD1蛋白的表達與患者一般人口學(xué)特征及臨床病理因素的關(guān)系;采用列聯(lián)系數(shù)分析ESCC組織中3指標的關(guān)聯(lián)性。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ESCC和正常食管黏膜組織中FOXO3a、EGFR和CyclinD1蛋白的表達 見圖1、表1～3。正常食管黏膜和ESCC組織中FOXO3a蛋白的陽性表達率分別為70.1%和13.8%，EGFR蛋白的陽性表達率分別為10.3%和64.4%，CyclinD1蛋白的陽性表達率分別為14.9%和72.4%。

圖1 ESCC和正常食管黏膜組織中FOXO3a(A)、EGFR(B)及CyclinD1(C)蛋白的表達(SP，×100)

表1 正常食管黏膜和ESCC組織中FOXO3a蛋白的表達 例

表2 正常食管黏膜和ESCC組織中EGFR蛋白的表達 例

表3 正常食管黏膜和ESCC組織中CyclinD1蛋白的表達 例

2.2 ESCC 組織中 FOXO3a、EGFR 和 CyclinD1蛋白的表達與患者一般人口學(xué)特征及臨床病理因素的關(guān)系 見表4。在ESCC組織中，F(xiàn)OXO3a蛋白的表達僅與組織學(xué)分級有關(guān);EGFR蛋白的表達與組織學(xué)分級、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān);CyclinD1蛋白的表達與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

表4 ESCC組織中3種蛋白的表達與患者一般人口學(xué)特征和臨床病理因素的關(guān)系 陽性例數(shù)(%)

2.3 ESCC 組織中 FOXO3a、EGFR、CyclinD1 蛋白表達的關(guān)聯(lián)性 見表5、6。

表5 ESCC組織中FOXO3a和EGFR、CyclinD1蛋白表達的關(guān)聯(lián)性 例

表6 ESCC組織中EGFR、CyclinD1蛋白表達的關(guān)聯(lián)性 例

3 討論

FOXO3a是叉頭轉(zhuǎn)錄因子O亞家族(forkhead transcription factor O subfamily，F(xiàn)OXO)中的一員，其在細胞增殖和凋亡中起核心作用[5-7]。FOXO3a在乳癌、卵巢癌、前列腺癌等組織中的表達水平下降[4]。該研究中FOXO3a在ESCC組織中的表達水平亦下降，且其陽性表達與腫瘤組織學(xué)分級有關(guān)，組織分化越高其表達水平越高，提示FOXO3a基因活性的降低可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，且其表達水平與腫瘤的惡性程度有關(guān)。

EGFR是一種由原癌基因c-erbB編碼的跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性。EGFR在多種惡性腫瘤細胞中高表達[8]。該研究中EGFR在ESCC組織中的陽性表達率高于正常食管黏膜組織，與王立東等[9]的EGFR在食管各級病變中的表達升高和尤超等[10]的EGFR在ESCC組織中高表達一致，且其陽性表達與組織學(xué)分級、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)。由此作者推測EGFR與腫瘤細胞的增殖、分化、細胞黏附力、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，EGFR蛋白高表達的患者腫瘤惡性程度高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。

CyclinD1是細胞從G1期進入S期的重要調(diào)控因子。CyclinD1在乳癌、肝癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中過表達[11]。該研究結(jié)果顯示CyclinD1蛋白在ESCC組織中亦高表達，其陽性表達與腫瘤的浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān);腫瘤浸潤越深，CyclinD1蛋白的表達越低，提示CyclinD1可能在癌變早期擴增，檢測CyclinD1有助于ESCC的早期診斷。

FOXO3a和EGFR均參與磷脂酰肌醇3-激酶/絲-蘇氨酸激酶(phosphoinositide 3-kinase/serine threonine kinase，PI3K/AKT)信號傳導(dǎo)通路。AKT依賴磷酸化 FOXO3a的調(diào)節(jié)作用[12]，EGFR在PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路中對細胞增殖、分化、播散起重要作用[13]。該研究結(jié)果顯示，在ESCC組織中FOXO3a與EGFR蛋白的表達呈負關(guān)聯(lián)，由此作者推測，EGFR原癌基因激活可通過PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路抑制FOXO3a基因的活性，下調(diào)FOXO3a蛋白的表達，共同參與ESCC的發(fā)生發(fā)展。FOXO3a與CyclinD1蛋白表達呈負關(guān)聯(lián)，提示FOXO3a轉(zhuǎn)錄可抑制CyclinD1的活性，進而影響細胞增殖與凋亡。另外，該研究結(jié)果還顯示CyclinD1與EGFR蛋白的表達呈正關(guān)聯(lián)。CyclinD1是EGFR在核內(nèi)的靶蛋白[14]，EGFR可直接轉(zhuǎn)運入核，調(diào)節(jié) CyclinD1基因轉(zhuǎn)錄，共同參與ESCC的發(fā)生。

綜上所述，F(xiàn)OXO3a、EGFR和CyclinD1與ESCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可為ESCC的早期診斷和預(yù)后評價提供一定的參考，并有望為治療提供新的靶點。

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