陳 纖 蔣友芹 尹曉明 田文倩 王敬東 楊紅英

（蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)及交叉學(xué)科研究院 蘇州 215123）

電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)指受照射細(xì)胞周圍沒有受到照射的細(xì)胞表現(xiàn)出來的生物學(xué)效應(yīng)。已有大量研究證明了旁效應(yīng)的存在[1-4]，但介導(dǎo)旁效應(yīng)的分子機(jī)制卻仍然不清楚。至今，已提出4種介導(dǎo)旁效應(yīng)的分子機(jī)制，包括細(xì)胞間縫隙連接、信號(hào)細(xì)胞膜上配體與旁效應(yīng)細(xì)胞膜上受體之間的相互作用、信號(hào)細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子或者生長(zhǎng)因子與其在旁效應(yīng)細(xì)胞膜上受體之間的相互作用以及細(xì)胞受照后分泌的各種可溶性分子[5]。最近，有報(bào)道指出細(xì)胞受照后分泌的外泌體可能介導(dǎo)旁效應(yīng)[6]。外泌體是一類多種細(xì)胞均可分泌的膜結(jié)構(gòu)囊泡[7-8]，直徑30-150nm，內(nèi)含蛋白質(zhì)、RNA和脂類，可介導(dǎo)細(xì)胞間通訊[9-11]。本研究以H460人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)細(xì)胞受照后分泌外泌體的特性，探討外泌體是電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)的一種可能的介導(dǎo)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H460購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；RPMI1640培養(yǎng)基、丙酮酸鈉和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich公司；FM4-64熒光染料購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；青霉素-鏈霉素、抗HSP90小鼠單克隆抗體、抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG(H+L)和 DiO熒光染料購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所；HEPES緩沖液購(gòu)自中國(guó)Robiot公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和輻照條件

H460細(xì)胞培養(yǎng)于含 10%胎牛血清、2.5g·L-1葡萄糖、1 mmol·L-1丙酮酸鈉、100 U·mL-1青霉素-鏈霉素和1 mmol·L-1HEPES的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于含5% CO2的培養(yǎng)箱中在37 ℃培養(yǎng)。提取外泌體實(shí)驗(yàn)中，為避免血清中外泌體的干擾，采用無血清培養(yǎng)基。

采用美國(guó)RAD SOURCE RS2000 X-射線機(jī)照射，劑量率為1.16 Gy·min-1。

1.2.2 收集條件培養(yǎng)液

本研究采用條件培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移法研究經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)[12]。細(xì)胞接種24 h后，更換新鮮培養(yǎng)液，接受 X-射線照射。在受照后 0到24 h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)收集條件培養(yǎng)液，并通過濾膜(Ф0.22 μm)過濾以除去細(xì)胞碎片。為方便起見，文中未受照射和受照射的條件培養(yǎng)液分別用 SCM(Conditioned medium from sham-irradiated cells)和RCM(Conditioned medium from irradiated cells)表示。另外，采用新鮮培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。

1.2.3 微核形成實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3萬個(gè)H460細(xì)胞接種在帶無菌小圓玻片的六孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別更換為新鮮培養(yǎng)液、條件培養(yǎng)液或者含外泌體的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)液，PBS快速洗滌2次，細(xì)胞用V甲醇: V乙酸=3:1固定10 min并風(fēng)干；細(xì)胞水化后用 DAPI (10 μg·mL-1)染色 2 min，PBS 洗滌后用抗熒光淬滅液封片。小圓玻片置于倒置熒光顯微鏡(DM2000, Leica, Germany)下進(jìn)行細(xì)胞觀察、計(jì)數(shù)。含微核的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)。

1.2.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H460細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)皿中，100個(gè)細(xì)胞/皿，每組3皿，第二天分別更換為新鮮培養(yǎng)液、條件培養(yǎng)液或含外泌體的新鮮培養(yǎng)液在 37 ℃、5% CO2條件下靜置培養(yǎng)14 d。棄去培養(yǎng)基，用甲醇固定，亞甲基藍(lán)染色，鏡下計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞集落。計(jì)算克隆形成率(%)和細(xì)胞克隆存活率：

克隆形成率=（克隆數(shù)／接種細(xì)胞數(shù)）×100%；

細(xì)胞克隆存活率=處理組克隆形成率／對(duì)照組克隆形成率。

1.2.5 外泌體的分離與提純

外泌體的分離和收集采用文獻(xiàn)[13]報(bào)道的方法。具體說來，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，20mL培養(yǎng)液培養(yǎng)1500萬細(xì)胞，首先用孔徑為0.22 μm的過濾器過濾，除去雜質(zhì)和懸浮細(xì)胞；然后進(jìn)行差速離心，300g離心10 min，2,000g離心10 min，10,000g離心30 min，以除去細(xì)胞碎片；上清再經(jīng)100,000g離心70 min，獲得細(xì)胞分泌的外泌體；外泌體經(jīng) PBS清洗，100,000g離心70 min并去除上清后重懸于PBS中，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆?。所有離心步驟均在4 ℃條件下進(jìn)行。采用總蛋白定量方法定量外泌體：大約900萬細(xì)胞的條件培養(yǎng)液能提取1 μg外泌體。

1.2.6 外泌體尺寸分析

用馬爾文激光粒度儀 Zetasizer Nano ZS 90(Malvern, UK)測(cè)量提取的各組外泌體的尺寸分布。

1.2.7 外泌體的透射電鏡鑒定

取100 μL（約5 μg）新鮮提取的外泌體溶液，用2%戊二醛固定30 min。將外泌體滴于230目碳支持膜上，2%乙酸雙氧鈾染色5 min，風(fēng)干，透射電鏡(TEM, JEM-200 CX, Jeol. Ltd., Japan)下觀察。

1.2.8 Western blotting檢測(cè)外泌體標(biāo)記物

提取外泌體，用細(xì)胞裂解液（0.1%曲拉通X-100,10 mmol·L-1Tris (pH =7.4)，10%甘油，150 mmol·L-1氯化鈉，5 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1原釩酸鈉，1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)和 0.1%蛋白酶抑制劑）在4 ℃裂解30 min，13000 r·min-14 ℃離心10 min后，吸取蛋白上清。用Bradford蛋白定量方法測(cè)定蛋白濃度，向樣品中加入 5×上樣緩沖液，95 ℃條件下，5 min使蛋白質(zhì)變性。然后采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，膜用含 5%脫脂奶粉的 TBST緩沖液進(jìn)行非特異性封閉，加入抗 HSP90小鼠單克隆抗體 4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)室溫孵育45 min。洗膜后，加入化學(xué)發(fā)光液，用多功能激光掃描成像系統(tǒng)（美國(guó)Amersham公司Typhoon 9410）進(jìn)行掃描和圖像分析。

1.2.9 外泌體與接收細(xì)胞的相互作用

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 3 萬個(gè) H460細(xì)胞接種在 35mm帶無菌小圓玻片的小皿內(nèi)。24 h后，細(xì)胞用濃度為 15 μg·mL-1的綠色細(xì)胞膜染料DiO在室溫下染色15 min，PBS洗滌兩次以去除未結(jié)合染料。同時(shí)，用濃度為 10 μg·mL-1的紅色細(xì)胞膜染料 FM 4-64 在37 ℃下孵育外泌體15 min后，PBS洗滌2次，洗掉未結(jié)合染料。然后將染色后的外泌體加入到染色后的細(xì)胞中于37 ℃培養(yǎng)30 min。細(xì)胞用4%多聚甲醛固定10 min后，用DAPI染色，加抗熒光淬滅液封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察、攝片。

1.2.10 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

接種10,000個(gè)細(xì)胞于96孔板中，24 h后，更換新鮮培養(yǎng)液或含外泌體的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，輕輕吸出培養(yǎng)液，PBS輕柔沖洗細(xì)胞，吸干后，用0.5%的結(jié)晶紫甲醇溶液室溫染色15 min，吸走結(jié)晶紫甲醇溶液，加入100 μL檸檬酸鈉 (pH =4.2)/50% 乙醇混合液震蕩30 min溶解結(jié)晶紫；用酶標(biāo)儀（BIO-TEK Power Wave XS, USA）檢測(cè)樣品在540nm處的吸光度值。以單純新鮮培養(yǎng)液組作為對(duì)照，對(duì)其它組樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究采用Origin 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和作圖，采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為Student’s t-test，p<0.05時(shí)，認(rèn)為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均來源于獨(dú)立的至少重復(fù)3次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，文中用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 X-射線可在 H460細(xì)胞中誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng)

本研究采用條件培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移法，探索了X-射線在H460細(xì)胞中誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng)。如圖1所示，將 5 Gy X-射線照射后 18 h的條件培養(yǎng)液(RCM)轉(zhuǎn)移到未做任何處理的旁效應(yīng)細(xì)胞，旁效應(yīng)細(xì)胞的微核形成率相對(duì)于未受照射條件培養(yǎng)液(SCM)轉(zhuǎn)移組增加了 3.5-5倍，細(xì)胞克隆存活率降低了8.3%。這些結(jié)果表明X-射線可在H460細(xì)胞中誘導(dǎo)由培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng)；并且5 Gy X-射線照射后的條件培養(yǎng)液和10 Gy X-射線照射后的條件培養(yǎng)液在旁效應(yīng)細(xì)胞中產(chǎn)生的微核形成率之間的差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明兩個(gè)不同劑量的電離輻射誘導(dǎo)相似的旁效應(yīng)。

圖1 X-射線在H460細(xì)胞中誘導(dǎo)由培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng): (a) H460旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)未受照和受照射后18 h條件培養(yǎng)液(SCM和RCM)培養(yǎng)后的微核形成率；(b) H460旁效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)未受照和受照射后18 h條件培養(yǎng)液(SCM和RCM)培養(yǎng)后的克隆存活率*與新鮮培養(yǎng)液和未受照條件培養(yǎng)液對(duì)照相比, p<0.05Fig.1 X-ray irradiation induced medium-mediated bystander effects: (a) the frequency of MN formation in unirradiated bystander H460 cells cultured in SCM or RCM harvested at 18 h post-irradiation; (b) The clonogenic cell survival of unirradiated bystander cells cultured in SCM or RCM harvested at 18 h post-irradiation*p<0.05, compared with fresh medium control and SCM control

2.2 外泌體性質(zhì)鑒定

已有大量文獻(xiàn)報(bào)道外泌體是細(xì)胞間信號(hào)傳遞的一種方式[9-11]。本研究探索了外泌體是否在電離輻射旁效應(yīng)中扮演著信號(hào)傳遞作用。首先分離外泌體，并鑒定其性質(zhì)。如圖 2a和2b所示，H460細(xì)胞不管是否受照，分泌的外泌體呈現(xiàn)典型的“盤杯狀”特征，大小在30-150nm之間。進(jìn)一步通過Western Blotting檢測(cè)普遍接受的外泌體標(biāo)志物HSP 90 β，確證提取物為外泌體（如圖 2c）。有趣的是，不管是否受到照射，H460細(xì)胞均分泌外泌體。但是兩種外泌體的粒徑卻完全不同，從 SCM 中提取的外泌體粒徑分布在60-165nm，從RCM中提取的外泌體粒徑分布在30-70nm（如圖2d）。這些結(jié)果提示照射明顯改變了細(xì)胞分泌外泌體的性質(zhì)。未發(fā)表數(shù)據(jù)還顯示細(xì)胞分泌的外泌體尺寸還依賴于細(xì)胞所受劑量和照射后時(shí)間。

圖2 從SCM和RCM中提取的外泌體性質(zhì)鑒定: (a)從SCM中提取的外泌體電鏡圖片; (b)從RCM中提取的外泌體電鏡圖片;(c) Western Blotting檢測(cè)外泌體標(biāo)志物Hsp 90 β; (d)從SCM和RCM中提取外泌體的粒徑分布Fig.2 Characterization of exosomes isolated from SCM and RCM: (a) TEM images of exosomes isolated from SCM;(b) TEM images of exosomes isolated from RCM; (c) Western blot analysis of protein marker (HSP 90β) of exosomes;(d) Size distribution of exosomes isolated from SCM and RCM

2.3 外泌體與H460接收細(xì)胞之間的相互作用

為了探索外泌體是介導(dǎo)電離輻射旁效應(yīng)的一種可能方式，將從SCM和RCM中提取的外泌體加入到H460接收細(xì)胞中孵育30 min。在此之前，將外泌體用紅色膜熒光染料染色，而接收細(xì)胞用綠色膜熒光染料染色。結(jié)果如圖3a和3b所示，從SCM和RCM中提取的外泌體均能迅速進(jìn)入H460接收細(xì)胞中，而且可能是通過膜融合的方式[14]（圖中橙色代表紅色和綠色的共定位）。這提示外泌體可以作為未受照射或受照射H460細(xì)胞向接收細(xì)胞傳遞信號(hào)物質(zhì)的一種載體。

圖3 從SCM(a)和RCM(b)中提取的外泌體進(jìn)入接收細(xì)胞紅色：FM 4-64外泌體染色；綠色：DiO細(xì)胞膜染色；藍(lán)色：DAPI細(xì)胞核染色Fig.3 Internalization of exosomes isolated from SCM (a) and RCM (b) into the recipient cells:exosomes were labeled with FM 4-64 (red); cell membranes were labeled with DiO (green); nuclei were stained with DAPI (blue)

2.4 從條件培養(yǎng)液提取的外泌體可誘導(dǎo)接收細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)

為了確證外泌體是電離輻射在H460細(xì)胞中誘導(dǎo)旁效應(yīng)的一種介導(dǎo)方式，將從SCM和RCM中提取的外泌體直接加入到H460接收細(xì)胞中。與對(duì)照相比，加入從 SCM 中提取的外泌體未改變接收細(xì)胞的微核形成率，而從RCM中提取的外泌體卻使接收細(xì)胞的微核形成率增加了兩倍（見圖 4a）。表明從受照射細(xì)胞培養(yǎng)液提取的外泌體與未照射條件下提取的外泌體性質(zhì)不同，前者可以在接收細(xì)胞中誘導(dǎo)生物學(xué)變化，提示外泌體是電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)的一種可能機(jī)制。并且當(dāng)先用RNA酶在37 ℃與外泌體孵育90 min后，再將外泌體加入接收細(xì)胞，之前觀察到的從RCM中提取的外泌體使接收細(xì)胞的微核形成率增加的生物學(xué)效應(yīng)消失了，表明外泌體中 RNA在其誘導(dǎo)微核形成增加中發(fā)揮著重要作用。然而，未發(fā)表數(shù)據(jù)顯示，不管是否受照，H460細(xì)胞分泌的外泌體均不改變接收細(xì)胞的克隆存活率，說明受照后條件培養(yǎng)液介導(dǎo)的克隆存活率降低可能并不是由外泌體介導(dǎo)的。另外，與新鮮培養(yǎng)液對(duì)照組相比,不管是否受照，H460細(xì)胞分泌的外泌體均能促進(jìn)接收細(xì)胞的增殖（大約11%，見圖4b），這表明，不管是否受照，H460細(xì)胞分泌的外泌體均可能介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)傳遞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

圖4 從SCM和RCM中提取純化的外泌體對(duì)接收細(xì)胞微核形成的影響(a)和從SCM和RCM中提取純化的外泌體對(duì)接收細(xì)胞增殖的影響(b): *與新鮮培養(yǎng)液對(duì)照相比, p<0.05; **與新鮮培養(yǎng)液對(duì)照相比, p<0.01Fig.4 The frequency of MN formation in the recipient cells cultured in medium with exosomes isolated from SCM and RCM (a)and the cell proliferation of the recipient cells cultured in medium with exosomes isolated from SCM and RCM(b)* p<0.05, compared with fresh medium control; ** p<0.01, compared with fresh medium control

3 討論

本研究證實(shí)了電離輻射可在H460非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)條件培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng)（見圖1），旁效應(yīng)細(xì)胞的微核形成增加，細(xì)胞克隆存活率降低，DNA損傷增加（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。這與文獻(xiàn)報(bào)道的X-射線照射H460細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放，從而產(chǎn)生表現(xiàn)為細(xì)胞存活和凋亡改變的旁效應(yīng)相一致[15]。盡管文獻(xiàn)[15]提示電離輻射在H460細(xì)胞中誘導(dǎo)的旁效應(yīng)可由腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體 TRAIL（TRAIL與促凋亡蛋白 PAR-4的核轉(zhuǎn)位有關(guān)）介導(dǎo)，本研究提供證據(jù)證實(shí)H460細(xì)胞受照后分泌的外泌體是誘導(dǎo)旁效應(yīng)的一種可能機(jī)制。

多細(xì)胞體系中，細(xì)胞間通訊對(duì)于各種類型細(xì)胞的正常組織和功能必不可少。除了被廣為接受的細(xì)胞間通訊機(jī)制，例如細(xì)胞間隙連接、釋放的生長(zhǎng)因子、化學(xué)因子和小分子包括多肽、離子、核酸和脂質(zhì)等，越來越多的證據(jù)表明外泌體-這種特殊的納米膜結(jié)構(gòu)囊泡，可以介導(dǎo)細(xì)胞間通訊[16]。外泌體是一類直徑在30-150nm，可由多種細(xì)胞，包括各種腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和正常細(xì)胞釋放的囊泡[7-8]。外泌體包含豐富的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和多種核酸，特別是miRNAs和通常以蛋白質(zhì)復(fù)合體形式存在并在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮關(guān)鍵作用的RNAs[10-11,16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，從未受照射和受照射細(xì)胞的條件培養(yǎng)液中均可提取到外泌體（圖2），表明H460非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞分泌外泌體既是組成型又是誘導(dǎo)型。這和之前的文獻(xiàn)報(bào)道有所不同，該報(bào)道顯示未受照H460細(xì)胞并不分泌可檢測(cè)的外泌體[18]。一個(gè)可能的原因是兩項(xiàng)研究中所用細(xì)胞培養(yǎng)條件和外泌體提取方法的不同。然而本研究發(fā)現(xiàn)H460細(xì)胞受照前后，其釋放的外泌體的尺寸分布不同，受照H460細(xì)胞釋放的外泌體比未受照細(xì)胞分泌的外泌體尺寸?。▓D2）。細(xì)胞受照前后分泌的外泌體大小不同提示受照后外泌體成分可能發(fā)生了變化。未發(fā)表數(shù)據(jù)表明，受照射細(xì)胞分泌的外泌體尺寸分布與細(xì)胞所受劑量和照射后培養(yǎng)時(shí)間相關(guān)，提示受照射細(xì)胞在不同劑量和不同培養(yǎng)時(shí)間情況下可能分泌不同的信號(hào)分子。

從未受照射和受照射細(xì)胞的條件培養(yǎng)液提取的外泌體可以迅速進(jìn)入接收細(xì)胞，可能是通過膜融合的方式[14]，見圖3中橙色，由不同膜染料的紅色和綠色疊加形成，表明 H460細(xì)胞釋放的外泌體可以直接將信號(hào)分子傳遞進(jìn)接收細(xì)胞。有趣的是，從受照射細(xì)胞條件培養(yǎng)液提取的外泌體顯著增加接收細(xì)胞的微核形成（圖4a）表明細(xì)胞受照后分泌的外泌體內(nèi)容物與未受照時(shí)不同。然而，不管受照射與否，H460細(xì)胞分泌的外泌體對(duì)接收細(xì)胞均有促增殖作用，兩者之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖 4b）。這與文獻(xiàn)報(bào)道膠質(zhì)瘤細(xì)胞釋放外泌體促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖類似[9]。未發(fā)表數(shù)據(jù)顯示不管是否受照，H460細(xì)胞分泌的外泌體均不改變接收細(xì)胞的克隆存活率。這些結(jié)果提示，不管是否受照射，H460 細(xì)胞分泌的外泌體均含有促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，但這些細(xì)胞因子對(duì)H460細(xì)胞的克隆存活率沒有影響；并且，細(xì)胞受照后釋放的外泌體中含有誘導(dǎo)微核形成的因子，這可能是照射后轉(zhuǎn)移條件培養(yǎng)液導(dǎo)致旁效應(yīng)細(xì)胞微核增加的機(jī)制之一。受照細(xì)胞釋放的外泌體能增加接收細(xì)胞的微核形成，但不改變接收細(xì)胞的克隆存活率，這些結(jié)果提示導(dǎo)致電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)的不同表現(xiàn)的機(jī)制可能不一樣。這與之前 Yang等[2]的報(bào)道相似，他們證實(shí)了活性氧淬滅劑可降低 X-射線在AG01522細(xì)胞中誘導(dǎo)的經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng)DNA損傷，但卻對(duì)旁效應(yīng)細(xì)胞殺傷沒有影響，從而提示電離輻射誘導(dǎo)的不同旁效應(yīng)可能存在不同的機(jī)制。

并且， RNA可能是受照細(xì)胞分泌的外泌體中重要的效應(yīng)分子，因?yàn)橛肦Nase處理外泌體可消除其增加接收細(xì)胞微核形成的效應(yīng)（圖 4a）。這與之前文獻(xiàn)[6]報(bào)道外泌體中 RNA 介導(dǎo)電離輻射旁效應(yīng)相一致。但是，在外泌體中加入RNase對(duì)接收細(xì)胞的增殖無影響（圖 4b）。這進(jìn)一步提示，外泌體中的促微核形成因子和促細(xì)胞增殖因子并不相同。

總之，本研究證實(shí)了X-射線照射H460細(xì)胞可誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng)，表現(xiàn)為微核增加和克隆存活率下降。另一方面，H460細(xì)胞可分泌組成型和誘導(dǎo)型外泌體，受照細(xì)胞分泌的外泌體與未受照射細(xì)胞分泌的外泌體在尺寸分布上有很大不同，兩者都可通過膜融合的方式迅速進(jìn)入接收細(xì)胞，從而促進(jìn)接收細(xì)胞的增殖；并且，受照細(xì)胞分泌的外泌體可導(dǎo)致接收細(xì)胞的微核形成率增加，而 RNA酶可抑制這種增加；但是受照細(xì)胞分泌的外泌體不影響接收細(xì)胞的克隆存活率。這些結(jié)果表明外泌體是介導(dǎo)電離輻射旁效應(yīng)的一種可能機(jī)制，其中 RNA發(fā)揮著重要作用。但是，未受照射和受照射細(xì)胞分泌的外泌體的蛋白質(zhì)和 RNA等成分構(gòu)成和引起接收細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的信號(hào)分子需要進(jìn)一步研究。

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