李東梅 洪承皎 張保國

（蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)院 江蘇省放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘇州 215123）

核仁素是核仁中含量最豐富的磷酸化蛋白，它具有多種生物學(xué)功能：調(diào)控核糖體的合成與成熟，參與細(xì)胞增殖、生長、胞質(zhì)分裂、染色質(zhì)復(fù)制、核仁的發(fā)生等。核仁素在正常細(xì)胞中分布在細(xì)胞內(nèi)，但在腫瘤細(xì)胞和快速分裂細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中過度表達(dá)并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜[1-2]。AS1411是核仁素的特異性核酸適配體，可以與腫瘤細(xì)胞表面的核仁素特異性結(jié)合[3-4]。AS1411是含26個(gè)堿基的G4序列核酸，目前已作為抗癌藥物進(jìn)入二期臨床試驗(yàn)研究，顯示出積極的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性[5-6]。AS1411通過干擾各種增殖信號以破壞核仁素及其結(jié)合伴侶的相互作用來提高它的抗腫瘤細(xì)胞增殖作用，這些信號通路有NF-kB通路、PRMT5致癌基因通路和bcl-2抗凋亡途徑等[3-7]。本課題組通過克隆形成實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明AS1411聯(lián)合X射線能夠降低照射后HeLa細(xì)胞的存活率，且HeLa細(xì)胞在AS1411濃度為500 nmol·L-1時(shí)的放射增敏比(SER)達(dá)到1.89[8]。本研究以人宮頸癌細(xì)胞HeLa為對象，從DNA損傷、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測方面進(jìn)一步研究 AS1411的輻射增敏機(jī)理，為其應(yīng)用于腫瘤放射治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

AS1411及其對照適配體 cApt（生工生物工程（上海）有限公司），AS1411序列為 5'-TTG GTG GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTGg-3'，cApt序列為5'-TTC CTC CTC CTC CTT CTC CTC CTC CTC C-3'。DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基、小牛血清（美國Gibco公司）、胰酶（蘇州恩泰試劑有限公司）、碘化丙啶(Propidium iodide, PI)染料（自美國Sigma公司）、抗γ-H2AX小鼠單克隆抗體（自美國Upstate公司）、二抗(羊抗鼠-FITC)（蘇州工業(yè)園區(qū)博美達(dá)試劑儀器有限公司）、BSA（Roche公司）、TritonX100（Amersharm公司）、DAPI染液和抗熒光淬滅封片劑（碧云天生物技術(shù)研究所）、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物有限公司），激光共聚焦顯微鏡(TCS SP2，Leica公司)，流式細(xì)胞儀(Cytomics FC500, Beckman Coulter)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma3111)，酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-TEK公司powerwave xs)，倒置顯微鏡(Olympus CK41)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

宮頸癌細(xì)胞株 HeLa為本實(shí)驗(yàn)室保存，置于含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶內(nèi)單層傳代培養(yǎng)，取指數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 AS1411和cApt儲存條件

AS1411和 cApt采用去離子水配制成濃度為1mmol·L-1的儲存液，于 4 ℃冰箱保存，使用時(shí)用DMEM培養(yǎng)基稀釋。

1.4 照射條件

應(yīng)用美國RADSOURCE公司RS2000PRO型X射線生物照射儀照射細(xì)胞，射線能量160 kV，照射劑量率1.15 Gy·min-1。照射時(shí)使用直徑60mm的一次性塑料培養(yǎng)皿(Gibco)，皿內(nèi)培養(yǎng)液總體積2mL，將培養(yǎng)皿平放于照射區(qū)域中央，距X源中心40 cm。

1.5 γ-H2AX免疫熒光法檢測DNA損傷

取指數(shù)生長期細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)皿中預(yù)先放置蓋玻片，種植于培養(yǎng)皿中爬片，設(shè)置正常對照組、單純藥物組、單純照射組和照射+藥物組，培養(yǎng)8 h至細(xì)胞貼壁。在單純藥物組、照射+藥物組中加入 AS1411(或 cApt)使終濃度為 500 nmol·L-1和1 μmol·L-1。24 h后，X射線照射單純照射組、照射+藥物組細(xì)胞，吸收劑量分別為0 Gy、4 Gy和8 Gy，照后2 h做相應(yīng)處理：加入抗γ-H2AX小鼠單克隆抗體(1: 500) 4 ℃冰箱中過夜，再于羊抗鼠-FITC二抗(1: 400)室溫孵育1 h，加入DAPI染液染核5 min，最后滴加6 μL抗熒光淬滅封片劑，將蓋玻片倒置在載玻片上，避光，在激光共聚焦顯微鏡下觀測每個(gè)細(xì)胞核內(nèi) DNA雙鏈斷裂所產(chǎn)生的熒光斑點(diǎn)數(shù)量。每個(gè)視野至少觀測100個(gè)細(xì)胞，記錄3個(gè)視野。

1.6 細(xì)胞周期檢測

取指數(shù)生長期細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)皿培養(yǎng)8 h至細(xì)胞貼壁。換用無血清DMEM培養(yǎng)基，同步化12 h分組：正常對照組、單純藥物組、單純照射組和照射+藥物組。單純藥物組、照射+藥物組加AS1411(cApt)使終濃度為 500 nmol·L-1和1μmol·L-1。24 h后，單純照射組、照射+藥物組 X射線照射細(xì)胞，照射劑量8 Gy，照射后于24 h時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞；制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為(5-10)×105mL-1，離心(1000 r·min-1, 5 min)，棄上清，用PBS洗2遍，加入70%冰乙醇1mL，吹打均勻，固定過夜，第2天加50 μɡ·mL-1PI染色液，置4 ℃避光染1 h后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測

取指數(shù)生長期細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，取 105個(gè)細(xì)胞種植于培養(yǎng)皿中，分設(shè)正常對照組、單純藥物組、單純照射組和照射+藥物組，培養(yǎng)8 h至細(xì)胞貼壁。單純藥物組、照射+藥物組中加入AS1411(cApt)使終濃度為 500 nmol·L-1和 1μmol·L-1。24 h 后，單純照射組、照射+藥物組用X射線照射細(xì)胞，吸收劑量分別為0 Gy、4 Gy和8 Gy，照射后24 h用胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為(2-5) ×105mL-1，離心(1000 r·min-1, 5 min)，懸浮細(xì)胞，Annexin V-FITC 和Propidium Iodide染色，避光染30 min后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè) 3個(gè)平行樣，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。應(yīng)用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用(±s)表示，重復(fù)測量采用方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AS1411對HeLa細(xì)胞DNA損傷的影響

圖 1和圖 2分別為使用共聚焦顯微鏡觀察AS1411和cApt聯(lián)合X射線照射對HeLa細(xì)胞DNA雙鏈斷裂情況，藍(lán)色(DAPI)為細(xì)胞核，紅色(γ-H2AX)為雙鏈斷裂點(diǎn)。圖3a、圖3b分別是依據(jù)圖1、圖2統(tǒng)計(jì)的平均每個(gè)細(xì)胞核中DNA斷裂點(diǎn)數(shù)的柱狀圖。從圖3a可以看出，吸收劑量為0 Gy時(shí)，AS1411加藥組與正常對照組無差別；吸收劑量為4Gy時(shí)，對照組、500 nmol·L-1/AS1411 組和 1 μmol·L-1/AS1411組核內(nèi)雙鏈斷裂斑點(diǎn)數(shù)分別為(9.681±2.13)個(gè)、(16.137±2.03)個(gè)和(21.024±2.25)個(gè)；吸收劑量為8 Gy時(shí)，對照組、500 nmol·L-1/AS1411組和 1 μmol·L-1/AS1411組核內(nèi)雙鏈斷裂斑點(diǎn)數(shù)分別為(20.789±2.73)、(45.685±3.04)和 (61.052±2.68)個(gè)；即AS1411能夠增加輻射對HeLa細(xì)胞DNA的雙鏈斷裂。從圖3b可以得到，吸收劑量為0 Gy時(shí)，cApt加藥組與正常對照組無差別；吸收劑量為4 Gy時(shí)，對照組、500 nmol·L-1/cApt 組和 1μmol·L-1/cApt組核內(nèi)雙鏈斷裂斑點(diǎn)數(shù)分別為(9.681±2.13)、(11.011±1.63)和(10.026±1.22)個(gè)；吸收劑量為 8 Gy時(shí)，對照組、500 nmol·L-1/cApt組和 1 μmol·L-1/cApt組核內(nèi)雙鏈斷裂斑點(diǎn)數(shù)分別為(20.789±1.73)、(19.057±1.86)和(21.052±2.16)個(gè)；即在同一照射劑量下，各組核內(nèi)雙鏈斷裂斑點(diǎn)數(shù)相比較無差別。

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察AS1411聯(lián)合X-射線照射對HeLa細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的影響Fig.1 Confocal microscopy images of AS1411 combined with X-ray irradiation on HeLa cells DNA double-strand breaks

圖2 激光共聚焦顯微鏡觀察cApt聯(lián)合X-射線照射對HeLa細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的影響Fig.2 Confocal microscopy images of cApt combined with X-ray irradiation on HeLa cells DNA double-strand breaks

圖3 不同濃度AS1411(a)、cApt (b)聯(lián)合X射線照射下平均每個(gè)細(xì)胞核中DNA斷裂點(diǎn)的數(shù)目Fig.3 The average number of DNA breakage points in each cell nucleus treated by AS1411 (a) and cApt (b) of different concentrations combined with X-ray irradiation

2.2 AS1411對HeLa細(xì)胞周期的影響

表1和表2分別為流式細(xì)胞儀檢測AS1411和cApt對HeLa細(xì)胞周期分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表1可看出，在不接受X射線照射條件下，不同濃度AS1411處理后G0/G1期、S期、G2/M期與正常對照組相比無明顯差別；8 Gy X-射線照射后出現(xiàn)G2/M期阻滯，但AS1411預(yù)處理并沒減少G2/M期阻滯，這表明AS1411增加HeLa細(xì)胞輻射增敏的機(jī)理與細(xì)胞周期無關(guān)。表2可看到，不接受X射線照射條件下，不同濃度cApt處理后與正常對照組相比較，各期細(xì)胞周期分布沒有發(fā)生變化；8 Gy X射線照射后出現(xiàn)G2/M期阻滯，cApt處理組與單純照射組相比無變化，可得出cApt對HeLa細(xì)胞周期分布沒有影響。

表1 AS1411不同處理組對HeLa細(xì)胞周期分布的影響Table 1 The effect of different treatment groups of AS1411 on Hela cell cycle distribution (%,±s)

表1 AS1411不同處理組對HeLa細(xì)胞周期分布的影響Table 1 The effect of different treatment groups of AS1411 on Hela cell cycle distribution (%,±s)

注: *與單純對照組相比，p<0.05。Note: *Compared with the control group, p<0.05.

組別/Grouping 樣本量/Sample number G0/G1 S G2/M Control 3 48.86±0.25 36.53±1.70 14.61±1.95 500 nmol·L-1 3 53.45±0.97 35.66±1.49 10.89±1.74 1 μmol·L-1 3 54.25±0.82 34.69±1.02 11.06±0.87 Irradiation 3 3.15±0.32 6.57±0.34 90.28±0.02 *Irradiation+500 nmol·L-1 3 3.82±0.48 9.09±0.30 87.09±0.58 *Irradiation+1 μmol·L-1 3 3.96±0.99 9.27±1.59 86.77±2.45 *

表2 cApt不同處理組對HeLa細(xì)胞周期分布的影響Table 2 The effect of different treatment groups of cApt on Hela cell cycle distribution (%, ±s)

表2 cApt不同處理組對HeLa細(xì)胞周期分布的影響Table 2 The effect of different treatment groups of cApt on Hela cell cycle distribution (%, ±s)

注: *與單純對照組相比，p<0.05。Note: *Compared with the control group, p<0.05.

組別/Grouping 樣本量/Sample number G0/G1 S G2/M Control 3 48.86±0.25 36.53±1.70 14.61±1.95 500nmol·L-1 3 48.06±3.48 35.75±0.53 16.19±2.93 1μmol·L-1 3 45.80±0.74 36.66±0.30 17.54±0.58 Irradiation 3 10.19±1.46 11.45±1.17 78.36±2.52 *Irradiation+500nmol·L-1 3 7.64±1.25 11.37±0.91 80.99±1.74 *Irradiation+1μmol·L-1 3 9.81±1.28 11.75±2.66 78.44±3.67 *

2.3 AS1411對輻射誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

表 3、表 4分別為流式細(xì)胞儀檢測的 AS1411和cApt聯(lián)合不同劑量X射線照射對HeLa細(xì)胞凋亡率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表3可見，在吸收劑量為0 Gy時(shí)，隨著AS1411濃度的增加，HeLa細(xì)胞的凋亡率也逐漸增高，即單獨(dú)用藥可增加細(xì)胞凋亡率；在相同照射劑量下，AS1411聯(lián)合X射線照射組較單純照射組的細(xì)胞凋亡率增加，且與濃度成正比關(guān)系，這表明AS1411可增加由輻射所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。由表4可見，cApt對HeLa細(xì)胞凋亡率沒有影響。

表3 不同濃度AS1411對HeLa細(xì)胞凋亡率的影響Table 3 The effect of different concentration of AS1411 on Hela cell apoptosis (%,±s)

表3 不同濃度AS1411對HeLa細(xì)胞凋亡率的影響Table 3 The effect of different concentration of AS1411 on Hela cell apoptosis (%,±s)

吸收劑量 / Gy Absorbed dose凋亡率/Apoptosis rate 0 nmol·L-1 500 nmol·L-1 1 μmol·L-1 0 5.86±0.8 7.71±1.51 8.91±1.04 4 15.44±1.41 19.67±1.90 21.31±1.74 8 35.90±1.92 39.02±1.91 41.99±0.65

表4 不同濃度cApt對HeLa細(xì)胞凋亡率的影響Table 4 The effect of different concentration of cApt on Hela cell apoptosis (%, ±s)

表4 不同濃度cApt對HeLa細(xì)胞凋亡率的影響Table 4 The effect of different concentration of cApt on Hela cell apoptosis (%, ±s)

吸收劑量 / Gy Absorbed dose凋亡率/Apoptosis rate 0 nmol·L-1 500 nmol·L-1 1 μmol·L-1 0 4.91±1.27 4.99±0.28 5.26±0.41 4 15.37±1.22 14.31±0.27 15.39±2.58 8 34.80±0.40 33.67±1.05 34.05±1.65

3 討論

輻射增敏劑(Radiosensitizing agents)的研究是腫瘤放射治療的一個(gè)重要研究方向。輻射增敏劑是能夠增強(qiáng)生物體放射敏感性的一類物質(zhì)，通過選擇性地殺傷乏氧腫瘤細(xì)胞、抑制放射損傷修復(fù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等來增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性，提高腫瘤治愈率，對于臨床治療具有重要意義。

核酸適配體AS1411具有多種優(yōu)越性能：親和力強(qiáng)、特異性高、制備廉價(jià)、高效快速、高穩(wěn)定性、尺寸小、易于修飾、免疫原性小和滲透性好等。核仁素是AS1411與細(xì)胞作用的靶點(diǎn)，AS1411能夠通過抑制核仁素的多種功能發(fā)揮抗腫瘤作用[3-4,9-10]，如引起抗-凋亡bcl-2蛋白表達(dá)量降低而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制NF-κB的活性，阻止DNA的復(fù)制等。Bates等[6]已經(jīng)研究了AS1411對80種人類細(xì)胞系的抗增殖活性，發(fā)現(xiàn)其幾乎對所有的腫瘤細(xì)胞增殖都有很好地抑制作用，而對正常細(xì)胞的毒性作用小。AS1411具有上述優(yōu)點(diǎn)，使其可以作為輻射增敏劑比較理想的候選者，本項(xiàng)研究希望進(jìn)一步證明用AS1411抑制核仁素的功能，來提高腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性。

雙鏈斷裂(DSBs)是電離輻射作用后 DNA最嚴(yán)重的損傷形式，DSBs修復(fù)缺陷導(dǎo)致輻射敏感性的顯著提高。DNA雙鏈斷裂后，斷裂點(diǎn)附近的組蛋白H2AX的C末端絲氨酸殘基會快速發(fā)生磷酸化，形成γ-H2AX。γ-H2AX數(shù)目可以用來檢測DSBs的數(shù)量[11]。由于γ-H2AX與DSB在數(shù)量上是l:l的關(guān)系，檢測γ-H2AX已成為探測DSB數(shù)量的金標(biāo)準(zhǔn)[12]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察不同濃度 AS1411聯(lián)合X射線對HeLa細(xì)胞DNA損傷的影響，結(jié)果顯示：劑量為0 Gy時(shí)，AS1411加藥組與正常對照組相比較無差別；劑量為 4 Gy、8 Gy時(shí)，500 nmol·L-1/AS1411 組和 1 μmol·L-1/AS1411 組核內(nèi)雙鏈斷裂斑點(diǎn)數(shù)明顯多于單純照射組；這表明AS1411能夠增加輻射對細(xì)胞DNA的雙鏈斷裂，即AS1411對HeLa細(xì)胞的輻射增敏機(jī)理與其增加DNA損傷作用有關(guān)。

細(xì)胞的輻射敏感性與多種因素有關(guān)，比如DNA雙鏈斷裂修復(fù)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、蛋白激酶C、表皮生長因子受體、細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的含量等[13]。在放射治療中，腫瘤細(xì)胞受到中、高劑量電離輻射照射后引起 DNA損傷，都會發(fā)生細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象，細(xì)胞周期的阻滯與細(xì)胞凋亡、分化密切相關(guān)，細(xì)胞通過G1/S期檢查點(diǎn)和G2/M檢查點(diǎn)保證細(xì)胞的復(fù)制[14]。當(dāng)DNA損傷程度超過細(xì)胞的修復(fù)能力時(shí)，凋亡相關(guān)基因?qū)⒈患せ?，則促使細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡的變化，從細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：在不接受X射線照射的條件下，不同濃度AS1411處理后G0/G1期、S期、G2/M期與單純對照組相比無明顯差別；8 Gy X射線照射后出現(xiàn)G2/M期阻滯，但AS1411預(yù)處理并沒有減少G2/M期阻滯，這表明AS1411增加HeLa細(xì)胞輻射敏感性的機(jī)理與細(xì)胞周期無關(guān)。從細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，AS1411提高HeLa細(xì)胞的凋亡率與藥物濃度正相關(guān)，表明 AS1411能夠促進(jìn)輻射誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡，這與之前的研究結(jié)果一致[4]。本課題組通過克隆形成實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明 AS1411聯(lián)合X射線可以降低照射后HeLa細(xì)胞的存活率，能夠提高HeLa細(xì)胞的放射敏感性[8]，本研究更進(jìn)一步證明AS1411通過增加輻射對HeLa細(xì)胞DNA的雙鏈斷裂、促進(jìn)輻射誘導(dǎo)的 HeLa細(xì)胞凋亡率的增加來提高其對 HeLa細(xì)胞的輻射增敏作用，將為宮頸癌的放射治療提供進(jìn)一步的理論依據(jù)和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但是其確切的增敏機(jī)制尚不確定，還有待于進(jìn)一步的深入研究。

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