劉蘊(yùn)琦 劉藝芳 肖一丁 張明子 王曉月 馬雪梅▲ 王友彬▲

1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100124；2.北京協(xié)和醫(yī)院，北京100032

兩種大鼠皮瓣缺血再灌注損傷模型的比較

劉蘊(yùn)琦1劉藝芳1肖一丁2張明子2王曉月1馬雪梅1▲王友彬2▲

1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100124；2.北京協(xié)和醫(yī)院，北京100032

目的比較大鼠腹部與背部缺血再灌注損傷（IRI）模型的差異，探討更為合適的動(dòng)物皮瓣IRI模型。方法選用健康SD雄性大鼠24只，隨機(jī)分成4組，每組各6只，分別為腹部皮瓣缺血再灌注（aIR）組，腹部皮瓣假手術(shù)（aSH）組，背部皮瓣缺血再灌注（d IR）組及背部皮瓣假手術(shù)（dSH）組。腹部皮瓣以腹壁下淺動(dòng)脈為蒂，背部皮瓣以髂腰淺動(dòng)脈為蒂。術(shù)后5 d，觀察大鼠死亡及皮瓣啃食損壞率，應(yīng)用激光多普勒血流灌注成像儀計(jì)算成活區(qū)域平均血流灌注量及皮瓣成活率，HE染色進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，TUNEL染色檢測(cè)皮瓣組織細(xì)胞的早期凋亡，計(jì)算凋亡細(xì)胞陽性指數(shù)（AI）。結(jié)果d IR組死亡率（0.0%）、皮瓣啃食損壞率（0.0%）低于aIR組的16.7%與50.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且d IR組炎性浸潤(rùn)情況弱于aIR組。aSH組與dSH組的皮瓣成活率[（59.90±8.94）%、（97.63±1.29）%]及成活區(qū)域平均血流灌注量[（125.54±14.52）、（149.38±13.69）PU]分別高于aIR組與d IR組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。aSH組與dSH組AI[（13.48±5.23）%、（6.70±3.97）%]分別低于aIR組與d IR組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。dIR組皮瓣成活率[（53.30±5.40）%]、成活區(qū)域平均血流灌注量[（100.46±15.93）PU]較aIR組[（30.77±11.53）%、（39.45±9.94）PU]高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。d IR組AI[（43.72±6.15）%]較aIR組[（57.78±17.38）%]低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論背部皮瓣缺血再灌注損傷模型是較腹部皮瓣更為理想的模型。

缺血再灌注損傷；動(dòng)物模型；大鼠；皮瓣

臨床上，應(yīng)用皮瓣進(jìn)行組織修復(fù)和器官再造時(shí)，常會(huì)發(fā)生皮瓣缺血再灌注損傷。較長(zhǎng)時(shí)間皮瓣缺血可引起缺血損傷，恢復(fù)血流灌注后，皮瓣的組織損傷會(huì)進(jìn)一步加重[1]，從而導(dǎo)致皮瓣部分或完全壞死，影響手術(shù)成功率，因此，研究減輕皮瓣缺血再灌注損傷的方法具有重要的臨床意義。皮瓣缺血再灌注損傷研究的動(dòng)物模型主要有豬、家兔和鼠類皮瓣模型等，其中又以大鼠皮瓣模型最為常用[2]。既往經(jīng)典的大鼠皮瓣缺血再灌注模型為腹部島狀皮瓣模型，此種模型在研究高壓氧[3]和干細(xì)胞處理[4]等方法對(duì)皮瓣缺血再灌注損傷的治療效果上取得了一定研究成果。但腹部皮膚常被大鼠啃食損壞，組織結(jié)構(gòu)完整性差，且感染情況嚴(yán)重，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性差。利用背部皮膚建立皮瓣缺血再灌注損傷模型成為研究皮瓣缺血再灌注損傷的新方法。本實(shí)驗(yàn)旨在比較兩種模型的優(yōu)劣。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用體重280～350 g，健康雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分成4組，每組各6只，分別為腹部皮瓣缺血再灌注（abdominal skin flap ischemia reperfusion，aIR）組：顯微血管夾夾閉右側(cè)腹壁下淺血管，阻斷供血6 h；腹部假手術(shù)（abdominal skin flap sham operation，aSH）組：不進(jìn)行缺血處理；背部皮瓣缺血再灌注（dorsal skin flap ischemia reperfusion，d IR）組：顯微血管夾夾閉左側(cè)髂腰淺動(dòng)脈，阻斷供血6 h；背部假手術(shù)（dorsal skin flap sham operation，dSH）組：不進(jìn)行缺血處理。動(dòng)物購(gòu)于北京華阜生物科技股份有限公司，喂養(yǎng)于20～25℃的環(huán)境中，術(shù)前術(shù)后均采用自由喂食和飲水。本實(shí)驗(yàn)遵循國(guó)際動(dòng)物委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定并經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 模型制備

1.2.1 腹部皮瓣模型制備10%水合氯醛（3mL/kg）麻醉后，參照Küntscher等[5]的類似實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將大鼠腹部剃毛，以腹中線為對(duì)稱軸設(shè)計(jì)寬6 cm、長(zhǎng)9 cm的皮瓣。術(shù)區(qū)消毒鋪巾后，將皮瓣沿設(shè)計(jì)線切開，顯露雙側(cè)腹壁下淺血管后，結(jié)扎并切斷左側(cè)動(dòng)脈，形成以右側(cè)腹壁下淺血管為蒂的腹部皮瓣，顯微血管夾阻斷供血6 h[6]，恢復(fù)皮瓣血供后將皮瓣原位縫合，皮瓣下置相應(yīng)大小的硅橡膠片。腹部假手術(shù)組大鼠不進(jìn)行缺血操作。

1.2.2 背部皮瓣模型制備大鼠經(jīng)10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，固定后備皮，以背部中線為對(duì)稱軸設(shè)計(jì)寬6 cm、長(zhǎng)9 cm的皮瓣。術(shù)區(qū)消毒鋪巾后，將皮瓣沿設(shè)計(jì)線切開，暴露出血管，結(jié)扎右側(cè)髂腰、雙側(cè)胸背淺動(dòng)脈，以左側(cè)髂腰淺動(dòng)脈為蒂，充分游離皮瓣，顯微血管夾阻斷供血6 h，恢復(fù)皮瓣血供后將皮瓣原位縫合，皮瓣下置相應(yīng)大小的硅橡膠片。背部假手術(shù)組大鼠不進(jìn)行缺血操作。

1.3 動(dòng)物存活率與皮瓣完整性觀察

術(shù)后觀察各組動(dòng)物的存活和皮瓣的啃食損壞狀況。由于自身啃食造成皮瓣部分缺失的視為皮瓣被啃食損壞。

1.4 皮瓣微循環(huán)檢測(cè)

激光多普勒可直接觀察皮瓣中的血流情況，監(jiān)測(cè)皮瓣的微循環(huán)，區(qū)分壞死和成活區(qū)域。術(shù)后第5天，將大鼠麻醉后，用激光多普勒血流灌注成像儀（LDF，PeriScan PIM3，Perimed AB，Sweden）觀測(cè)皮瓣血流情況。方法：將激光探頭置于皮瓣區(qū)上部，設(shè)定相應(yīng)的觀測(cè)范圍，包含皮瓣及周圍正常皮膚。對(duì)設(shè)定區(qū)域的皮膚血流灌注量進(jìn)行測(cè)量后，LDF自動(dòng)報(bào)告測(cè)定范圍內(nèi)不同部位皮膚血流量數(shù)據(jù)及不同顏色圖像。紅色代表皮瓣血流灌注量最大，黑色代表最小甚至沒有血流灌注，黃色和藍(lán)色介于二者之間。圖像顏色和皮瓣成活情況的關(guān)系是，紅色、黃色以及與三者相連的藍(lán)色區(qū)域視為皮瓣成活區(qū)，黑色視為皮瓣壞死區(qū)，藍(lán)黑交界處視為皮瓣成活與壞死分界線。根據(jù)該分界線用移動(dòng)鼠標(biāo)在圖像上人工標(biāo)定皮瓣成活區(qū)（即紅、黃和相鄰部分藍(lán)色區(qū)域），其面積值由與LDF配套連接的計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算生成并依此計(jì)算出皮瓣成活率。皮瓣成活率=（成活區(qū)域面積/皮瓣總面積）×100%。

1.5 HE染色觀察

于皮瓣蒂部的近端部位取1 cm2大小組織塊，中性福爾馬林緩沖液固定，石蠟包埋，制作切片，脫蠟水化，蘇木精（中杉金橋，5mL）5min，1%鹽酸酒精分化，伊紅（中杉金橋，100 mL）5 min，自來水返藍(lán)10 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。觀察皮膚的組織學(xué)變化。

1.6 凋亡檢測(cè)

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d-UTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）標(biāo)記凋亡細(xì)胞：皮瓣組織切片脫蠟水化，置細(xì)胞通透液室溫8 min，加入TUNEL反應(yīng)混合液（Roche，Switzerland，50Tests），37℃孵育1 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，加入Converter-POD，37℃孵育30 min，PBS清洗，DAB（中杉金橋，10 mL）染色，蘇木精復(fù)染，封片鏡檢。在病變典型處連續(xù)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野（400×），每視野記數(shù)300個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)目及總細(xì)胞數(shù)目，以陽性細(xì)胞數(shù)所占總細(xì)胞數(shù)的百分比作為凋亡細(xì)胞陽性指數(shù)（AI），AI=（凋亡細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目）×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS l7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物存活率與皮瓣完整性

假手術(shù)組均未見死亡。術(shù)后第2天aIR組死亡1只，死亡率為16.7%，d IR組未見死亡，死亡率為0.0%。術(shù)后5 d，aIR組皮瓣啃食損壞率為50.0%，d IR組為0.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 皮瓣微循環(huán)檢測(cè)

術(shù)后5 d，成活皮瓣質(zhì)地柔軟、顏色新鮮，壞死區(qū)域干癟，顏色呈深棕或黑色。LDF掃描圖像，壞死區(qū)域顏色為黑色（圖1，封三）。根據(jù)LDF測(cè)出各組的成活區(qū)域平均血流灌注量，aSH組皮瓣成活率[（59.90± 8.94）%]、成活區(qū)域平均血流灌注量[（125.54±14.52）PU]及dSH組皮瓣成活率[（97.63±1.29）%]、成活區(qū)域平均血流灌注量[（149.38±13.69）PU]分別高于aIR組與d IR組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。d IR組皮瓣成活率為（53.30±5.40）%，成活區(qū)域平均血流灌注量為（100.46±15.93）PU，高于aIR組的（30.77± 11.53）%和（39.45±9.94）PU，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 HE染色觀察

利用HE染色分析組織的炎性浸潤(rùn)情況（圖2，封三），aIR組皮瓣組織內(nèi)大量炎癥細(xì)胞聚集，炎癥細(xì)胞胞核被染成藍(lán)色，多于d IR組，aSH組與dSH組皮瓣組織內(nèi)基本未見炎癥細(xì)胞聚集。

2.4 凋亡檢測(cè)

凋亡染色完成后用顯微鏡觀察染色情況（圖3，封三），觀察結(jié)果顯示：aIR組與d IR組，TUNEL染色主要位于基底層細(xì)胞的核上，呈顏色深淺不一的棕色凋亡細(xì)胞。aSH組AI[（13.48±5.24）%]與dSH組AI [（6.70±3.97）%]分別低于aIR組[（57.78±17.38）%]與d IR組[（43.72±6.15）%]，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。d IR組AI低于aIR組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。同時(shí)d IR組凋亡細(xì)胞染色程度較aIR組明顯降低。aSH組與dSH組由于未進(jìn)行缺血處理，未見明顯凋亡細(xì)胞。

3 討論

腫瘤切除及各種創(chuàng)傷常會(huì)造成體表組織器官的缺損，皮瓣移植是修復(fù)這類缺損的主要方法[7-8]。皮瓣部分或全部壞死將導(dǎo)致手術(shù)的失敗，皮瓣壞死主要的原因是持續(xù)性皮瓣缺血或暫時(shí)缺血以及其后的缺血再灌注損傷。大鼠腹部皮瓣缺血再灌注模型能引起較單純?nèi)毖?，并且能直觀地顯示損傷程度，因此廣泛地運(yùn)用于皮瓣缺血再灌注損傷方面的研究[9]。但在實(shí)際造模中發(fā)現(xiàn)，腹部模型大鼠死亡率、皮瓣啃食損壞率高，血流恢復(fù)緩慢，皮瓣成活率及凋亡指數(shù)不穩(wěn)定，導(dǎo)致造模效率低。

本實(shí)驗(yàn)中，假手術(shù)組皮瓣成活率及成活區(qū)域平均血流灌注量顯著高于各自的缺血再灌注組，凋亡指數(shù)也顯著低于缺血再灌注組，這表明各組模型的建立是成功的。大鼠存活過程中，腹部皮瓣與墊料長(zhǎng)時(shí)間頻繁接觸，傷口受外界感染概率大且濕度較高，因存在個(gè)體差異，實(shí)驗(yàn)組內(nèi)個(gè)體的炎性反應(yīng)差別大，對(duì)研究皮瓣缺血再灌注損傷引發(fā)的無菌性炎癥以及所表達(dá)的炎癥因子的定量研究影響較大[10]，對(duì)凋亡因子的研究也有較大影響，同時(shí)還造成aIR組AI[（57.78± 17.38）%]較d IR組[（43.72±6.15）%]穩(wěn)定性差。在傷口愈合及皮瓣壞死過程中，局部不適感可引起大鼠啃食皮瓣，使皮瓣模型的損壞率上升。在正常狀態(tài)下，大鼠腹部皮瓣平均血流灌注量低于背部，經(jīng)血管夾夾閉并松開后，血流恢復(fù)緩慢，相比于缺血再灌注損傷造成的壞死，因缺血造成的皮瓣壞死面積所占比例增加，降低了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。

近年來，Vourtsis等[11]、Wang等[12]分別研究了VEGF和bFGF對(duì)缺血再灌注損傷皮瓣成活的影響，Lima等[13]研究了電針刺激對(duì)皮瓣缺血再灌注損傷中氧化應(yīng)激程度的影響，Vasilenko等[14]、Li等[15]分別研究了甲酸雌二醇和富含血小板的血漿對(duì)皮瓣缺血再灌注損傷皮瓣成活的影響，這些研究均采用大鼠背部皮瓣模型，這些研究大都采用背部任意皮瓣模型。目前，在皮瓣缺血再灌注損傷導(dǎo)致的皮瓣壞死與凋亡的通路研究中，背部皮瓣模型也更多地被應(yīng)用。腹部皮瓣與背部皮瓣因所處位置的不用，兩種皮瓣的血管分布、組織厚度和血運(yùn)情況也存在差距。盡管更為復(fù)雜的如細(xì)胞因子等表達(dá)的差異難以進(jìn)行直接比較，但從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成活率、皮瓣完整程度、皮瓣成活率及凋亡指數(shù)的穩(wěn)定性等直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)成功率的指標(biāo)上考量，背部皮瓣模型在研究皮瓣缺血再灌注損傷時(shí)更具優(yōu)勢(shì)。

[1]Jennings RB，Sommers HM，Smyth GA，et al.Myocardial necrosis induced by temporary occlusion ofa coronary artery in the dog[J].Archives of Pathology，1960，70：68-78.

[2]CarrollWR，Esclamado RM.Ischemia/reperfusion injury in microvascular surgery[J].Head Neck，2000，22（7）：700-713.

[3]Qi Z，Gao CJ，Wang YB，et al.Effects of hyperbaric oxygen preconditioning on ischemia-reperfusion inflammation and skin flap survival[J].Chin Med J（Engl），2013，126（20）：3904-3909.

[4]Reichenberger MA，Heimer S，Schaefer A，et al.Adipose derived stem cells protect skin flaps against ischemiareperfusion injury[J].Stem Cell Rev，2012，8（3）：854-862.

[5]Küntscher MV，Schirmbeck EU，Menke H，et al.Ischemic preconditioning by brief extremity ischemia before flap ischemia in a ratmodel[J].Plast Reconstr Surg，2002，109（7）：2398-2404.

[6]戚征，高春錦，孫學(xué)軍，等.高壓氧預(yù)處理促進(jìn)皮瓣成活的研究[J].中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志，2009，15（1）：46-48.

[7]申五一，柏亞萍，張理梅，等.局部皮瓣在頭面部缺損修復(fù)中的應(yīng)用[J].中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志，2011，17（4）：308-309.

[8]詹太國(guó)，詹領(lǐng)，熊小剛，等.局部皮瓣在頭面部皮膚腫瘤及皮膚病切除修復(fù)中的應(yīng)用[J].中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志，2008，14（6）：370-372.

[9]Ames A，Wright RL，Kowada M，et al.Cerebral ischemiaⅡthe no-reflow phenormenon[J].Am JPathol，1968，52（2）：437-453.

[10]覃仕瑞，趙嶺，謝飛，等.取樣方式對(duì)大鼠皮瓣缺血再灌注損傷模型細(xì)胞因子測(cè)定的影響[J].中國(guó)生物工程，2012，32（4）：67-71.

[11]Vourtsis SA，Spyriounis PK，Agrogiannis GD，et al.VEGF application on rat skin flap survival[J].J Invest Surg，2012，25（1）：14-19.

[12]Wang Y，Orbay H，Huang C，et al.Preclinical efficacy of slow-release bFGF in ischemia-reperfusion injury in a Dorsal Island skin flap model[J].JReconstr Microsurg，2013，29（5）：341-346.

[13]Lima LP，Albuquerque AD，Silva JJD，et al.Electroacu puncture attenuates oxidative stress in random skin flaps in rats[J].Aesthetic Plastic Surgery，2012，36（5）：1230-1235.

[14]Vasilenko T，Slezakm KM，NovotnyM，etal.Pre-and/orpostsurgical administration of estradiol benzoate increases skin flapviabilityin female rats[J].AestheticPlastic Surgery，2013，37（5）：1003-1009.

[15]LiW，Enomoto M，Ukegawa M，et al.Subcutaneous injectionsofplatelet-richplasma intoskin flapsmodulateproangiogenic gene expression and improve survival rates[J]. Plast Reconstr Surg，2012，129（4）：858-866.

Com parison of two skin flap ischem ia reperfusion injury models on rats

LIU Yunqi1LIU Yifang1XIAO Yiding2ZHANGMingzi2WANG Xiaoyue1MA Xuemei1▲WANG Youbin2▲
1.College of Life Science and Bio-engineering,Beijing University of Technology,Beijing 100124,China; 2.Peking Union Medical College Hospital,Beijing 100032,China

Objective To investigate amore appropriate animal skin flap model of ischemia reperfusion injury(IRI)by comparing the differences between abdominal and dorsal skin flap model of IRI on rats.M ethods 24 healthy adult male Sprague-Dawley rats were random ly divided into four groups,with 6 rats in each group:abdominal skin flap ischemia reperfusion(aIR)group,abdominal skin flap sham operation(aSH)group,dorsal skin flap ischemia reperfusion (dIR)group and dorsal skin flap sham operation(dSH)group.Superficial inferior epigastric artery was the pedicel of abdominal skin flap,while dorsal skin flap using iliolumbar shallow artery as its pedicel.5 days after operation, calculated the survival rate and flap damage rate of gnawing were observed.Average blood perfusion unit of survival area and flap survival rate wasmeasured by Laser Doppler blood perfusion imager.HE staining was used to observe morphological changes,early apoptosis in skin flap through TUNEL staining was observed and the apoptotic index(AI) was calculated.Results Both the death rate of rats and flap damage rate of gnawing were 0.0%in d IR group,lower than those of aIR group(16.7%and 50.0%),the differenceswere statistically significant(P＜0.05).On inflammatory infiltration,d IR group wasweaker than aIR group.The aSH group and dSH group skin flap survival ratewere(59.90± 8.94)%and(97.63±1.29)%,the blood perfusion of survival areas were(125.54±14.52)PU and(149.38±13.69)PU,the differences were statistically significant(P＜0.01).The AI in aSH group and dSH group were(13.48±5.23)%and (6.70±3.97)%,whichwere lower than those in aIR group and d IR group,the differenceswere statistically significant(P＜0.01).The skin flap survival rate and blood perfusion in d IR group were(53.30±5.40)%and(100.46±15.93)PU,which were higher than those in aIR group[(30.77±11.53)%and(39.45±9.94)PU],the differences were statistically significant(P＜0.01).AIin d IR group[(43.72±6.15)%]was lower than that in aIR group[(57.78±17.38)%],the difference was statistically significant(P＜0.01).Conclusion Compared with the abdominal skin flap in rats,the dorsal skin flap ismuchmore appropriate in building IRImodel.

Ischemia reperfusion injury;Animalmodel; Rat;Skin flap

R363

A

1673-7210（2014）08（a）-0009-04

2014-03-11本文編輯：蘇暢）