甘彩霞+袁偉玲+王晴芳+崔磊+梅時勇

摘要:從12個蘿卜黑斑病菌(Alternaria sp.)菌株里篩選產(chǎn)孢最多的菌株,從8種培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、面粉培養(yǎng)基、豆芽培養(yǎng)基、玉米培養(yǎng)基、杏仁培養(yǎng)基)中篩選其最適合的培養(yǎng)基,研究溫度、光照、培養(yǎng)時間對其的影響。結(jié)果表明, 在12個菌株中JZHB7菌株產(chǎn)孢最多;豆芽培養(yǎng)基為JZHB7產(chǎn)孢的最佳培養(yǎng)基;JZHB7孢子15 ℃時萌發(fā)率高, 0 ℃時萌發(fā)率低;JZHB7培養(yǎng)4~7 d菌絲生長較快, 10~13 d生長較慢;日光燈照射培養(yǎng)2 h產(chǎn)孢量多,照射培養(yǎng)24 h產(chǎn)孢量少。

關(guān)鍵詞:蘿卜黑斑病菌(Alternaria sp.);JZHB7菌株;生物學(xué)特性;產(chǎn)孢量;培養(yǎng)基

中圖分類號:S436.31文獻標識碼:A文章編號:0439-8114(2014)10-2312-04

The Biological Characteristics of Radish Alternaria and the Screening of the Medium

GAN Cai-xia,YUAN Wei-ling,WANG Qing-fang,CUI Lei,MEI Shi-yong

(Institute of Economic Crops,Hubei Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430064,China)

Abstract:The bacterial strain with the largest sporulation quantity was chosen from the 12 Alternaria sp. bacterial strains and the optimal medium was selected from 8 media including PDA medium, PSA medium, beef extract peptone medium, YPD medium, flour medium, bean sprouts medium, corn medium,almond medium. The influence of temperature, light, treatment time on sporulation of Alternaria sp. were studied. The results showed that JZHB7 Alternaria had the largest sporulation quantity. Bean sprouts medium was the best medium among the eight kinds of media,JZHB7 Alternaria spores germination reached the maximum at 15 ℃ and the minimum at 0 ℃. JZHB7 Alternaria strains grew fast from 4 d to 7 d and slow from the 10 d to 13 d. Sporulation quantity of JZHB7 Alternaria increased in 2 h and decreased in 24 h.

Key words: radish black spot disease(Alternaria sp.); JZHB7 Alternaria; biological characteristics; sporulation quantity; medium

基金項目:湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心資助項目(2013-620-007-003)

蘿卜黑斑病是世界各地蘿卜產(chǎn)區(qū)的重要病害,不僅危害蘿卜而且對其他十字花科蔬菜也具有嚴重的危害性[1]。十字花科黑斑病由鏈格孢屬(Alternaria)病菌引發(fā),主要由蕓薹鏈格孢(Alternaria brassicae)、蕓薹生鏈格孢(Alternaria brassicicola)、蘿卜鏈格孢(Alternaria japonica)侵染引起[2],鏈格孢屬黑斑病菌在PDA培養(yǎng)基上菌落初為白色,后轉(zhuǎn)為暗灰色。菌絲近無色,有隔,直徑 2~8 μm;分生孢子梗一般單生,少數(shù)束生。在培養(yǎng)基上分生孢子著生在菌絲的分枝上,在葉片上一般單生,而在PDA培養(yǎng)基上可2~3個串生;在培養(yǎng)基上可形成大的厚垣孢子,一般串生,少數(shù)單生,近球形,暗黑褐色,表面光滑,一般直徑為菌絲的2~4倍[3]。

本研究主要觀察蘿卜黑斑病菌的生物學(xué)性狀,篩選產(chǎn)孢量高的菌株和相應(yīng)培養(yǎng)基,研究環(huán)境溫度、光照、培養(yǎng)時間對其的影響,為蘿卜抗黑斑病育種奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

菌種:蘿卜主產(chǎn)區(qū)黑斑病病樣分離培養(yǎng)菌株12株,分別為HB1、HB2、JZHB2、JZHB5、JZHB7、JZHB8、JZHB10、WHHB1、WHHB2、WHHB4、WHHB9、HHB10,于4 ℃冰箱中試管斜面保存。

培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、面粉培養(yǎng)基、豆芽培養(yǎng)基、玉米培養(yǎng)基、杏仁培養(yǎng)基,經(jīng)高壓蒸氣滅菌(121 ℃,30 min)。具體情況見表1。

1.2試驗方法

菌株篩選:在超凈工作臺上用無菌挑針從各菌種中挑取適量孢子在PDA培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)活化,每一菌株活化3個皿,10 d左右可長出完整的菌絲,轉(zhuǎn)接,20 d后從中選出產(chǎn)孢量最高的菌株。

接種和培養(yǎng):將選定菌株接種到8種培養(yǎng)基上,每個培養(yǎng)基3個重復(fù)。接種完后做好記錄,培養(yǎng)皿倒置, 15~20 d培養(yǎng)基表面長滿菌絲。將同一培養(yǎng)皿中菌絲用帶紗布漏斗過濾,無菌水沖洗定容至40 mL,顯微鏡檢、血球板計數(shù)(25格×16格,5點取樣),3次重復(fù)。確定最佳培養(yǎng)基。

將篩選出的菌株接種到篩選出的培養(yǎng)基上測定不同溫度對孢子萌發(fā)的影響。溫度分別設(shè)置為0、15、25、35 ℃,處理10 min, 培養(yǎng)24 h, 3個重復(fù)。顯微鏡檢、血球板計數(shù),測定其產(chǎn)孢總數(shù)和萌發(fā)數(shù),計算孢子萌發(fā)率。孢子萌發(fā)率=孢子萌發(fā)數(shù)/孢子總數(shù)×100%。

將篩選出的菌株接種到篩選出的培養(yǎng)基上,同一溫度下培養(yǎng)4、7、10、13 d,觀察菌落特征,測量菌落直徑。

將培養(yǎng)9 d后的培養(yǎng)基分別用40 W紫外燈和40 W日光燈照射1、2、8、24 h,測定不同光照及時間對孢子萌發(fā)的影響。

2結(jié)果與分析

2.1菌株的篩選

活化后的菌株通過PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d,觀察產(chǎn)孢情況(圖1),可見JZHB7在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大,顯著高于其他菌株(P<0.05,SPSS)。

2.2培養(yǎng)基的篩選

JZHB7菌株在8種培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d的產(chǎn)孢情況見圖2。由圖2可以看出,菌株JZHB7在面粉培養(yǎng)基和豆芽培養(yǎng)基上產(chǎn)孢均多,產(chǎn)孢量與其他培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量差異顯著(P<0.05,SPSS),在豆芽培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量高于面粉培養(yǎng)基,兩者差異不顯著(P>0.05,SPSS)。

2.3溫度對孢子萌發(fā)的影響

不同溫度條件下JZHB7菌株的孢子萌發(fā)情況見圖3。JZHB7菌株孢子在15 ℃時萌發(fā)率最高,在0 ℃時萌發(fā)率最低。在0~15 ℃隨溫度升高孢子萌發(fā)顯著增多,在15~35 ℃隨溫度升高孢子萌發(fā)顯著減少,說明高溫抑制孢子的萌發(fā),4個溫度條件下孢子萌發(fā)率差異均顯著(P<0.05,SPSS)。

2.4培養(yǎng)時間對菌絲生長的影響

在25 ℃時JZHB7菌落的生長狀況見圖4-圖8。從圖4可看出,JZHB7菌絲在4~7 d生長較快, 10~13 d生長較慢, 4個測量時間的菌落直徑差異均顯著(P<0.05,SPSS)。

2.5不同光照對產(chǎn)孢的影響

JZHB7菌株用豆芽培養(yǎng)基培養(yǎng)9 d后用40 W紫外燈及40 W日光燈分別照射1、2、8、24 h, 觀察對產(chǎn)孢量的影響(圖9)。JZHB7菌株在紫外燈照射下產(chǎn)孢量遠低于日光燈,兩者差異顯著(P<0.05, SPSS)。日光燈照射2 h時產(chǎn)孢最多, 照射24 h產(chǎn)孢最少,但產(chǎn)孢量差異不顯著(P>0.05, SPSS)。比較兩種光源對黑斑病菌產(chǎn)孢的促進效能,顯然日光燈要高于紫外燈。

3小結(jié)與討論

張?zhí)煊頪4]研究表明,部分鏈格孢不同種間菌絲形態(tài)的差異小,只有在菌絲產(chǎn)生一些特殊結(jié)構(gòu)時才有分類學(xué)上的鑒別價值;鏈格孢屬不同種之間在菌落形態(tài)、生長速度等方面常有差別,菌落作為種級鑒別特征對個別種有參考價值。在本研究過程中,12種蘿卜黑斑病菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d,可以較為明顯地觀察到菌絲的生長形態(tài)和變化,20 d后通過顯微鏡可以較為方便地統(tǒng)計鏈格孢的產(chǎn)孢數(shù)量, JZHB7菌株在12個菌株中產(chǎn)孢量最高。

肖長坤等[5]篩選出適合黑斑病菌生長的PDA、PSA和SNA 3種培養(yǎng)基,其中在PDA培養(yǎng)基上供試菌株生長速率均比較快,因此PDA培養(yǎng)基是一種適宜用來大量培養(yǎng)黑斑病菌菌絲體的培養(yǎng)基,這也與已有的相關(guān)報道結(jié)果一致;SNA培養(yǎng)基同樣適宜培養(yǎng),其具有一定的種間選擇性和促進產(chǎn)孢的作用,適合用于病原菌分離、純化和鑒定[6]。

對于鏈格孢的適宜培養(yǎng)基已有類似報道[7]。本研究發(fā)現(xiàn)鏈格孢JZHB7在多種培養(yǎng)基上能生長,不同的培養(yǎng)基上菌絲生長速率以及菌落形態(tài)有較大差異,其中,在豆芽培養(yǎng)基上生長最好,產(chǎn)孢量最大。

JZHB7菌株在0~35 ℃范圍內(nèi)孢子均可萌發(fā);最適孢子萌發(fā)溫度為15 ℃,此時萌發(fā)率最高;0 ℃時萌發(fā)率最低;15~35 ℃孢子萌發(fā)率隨溫度上升而降低。這與前人[8-11]的研究結(jié)果相似。

JZHB7菌株培養(yǎng)4~7 d生長較快, 10~13 d生長較慢。這與已有的研究結(jié)果[12]基本相符。

紫外燈照射不利于JZHB7產(chǎn)孢,日光燈照射2 h產(chǎn)孢最多, 24 h產(chǎn)孢最少。

參考文獻:

[1] 鄭建秋,胡榮娟,王艷梅,等.秋白菜黑斑病產(chǎn)量損失關(guān)鍵期分析[J].北京農(nóng)業(yè)科學(xué),1994,12(2):39-40.

[2] 呂佩珂,蘇慧蘭,高振江,等.中國現(xiàn)代蔬菜病蟲原色圖鑒[M]. 呼和浩特:遠方出版社,2008.

[3] 李明遠.蘿卜鏈格孢形態(tài)學(xué)的研究[J].華北農(nóng)業(yè)學(xué)報,1993,8(3):98-101.

[4] 張?zhí)熳?中國真菌志第十六卷 鏈格孢屬[M].北京:科學(xué)出版社,2003.

[5] 肖長坤,李勇,李健強.十字花科蔬菜種傳黑斑病研究進展[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2003,8(5):61-68.

[6] 閻淑娟,董金皋,樊幕貞.白菜黑斑病菌營養(yǎng)生長與毒素產(chǎn)生關(guān)系的初步研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1998,21(1):23-26.

[7] 李多川,張?zhí)煊?鏈格孢屬(絲孢綱)數(shù)值分類研究初探[J].真菌學(xué)報,1993,12(3):239-246.

[8] 蔡吉苗,李超萍,時濤,等.木薯炭疽病病原鑒定及其生物學(xué)特性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(10):5435-5438.

[9] 任小杰,梁艷,陸金萍,等.上海地區(qū)草莓炭疽病病原鑒定[J].植物病理學(xué)報,2008,38(3):325-328.

[10] 林清洪,林光榮,劉福平,等.鶴望蘭炭疽病的生物學(xué)特性及殺菌劑的藥效研究[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報,2006,21(3):13-20.

[11] 范曉龍,朱建華,周旭,等.南方紅豆杉炭疽病病原鑒定及其生物學(xué)特性[J].福建林學(xué)院學(xué)報,2006,26(2):117-122.

[12] 肖長坤,吳學(xué)宏,李健強.白菜黑斑病菌三個種菌株基本培養(yǎng)條件比較[J].菌物學(xué)報,2004,23(4):573-579.

2.3溫度對孢子萌發(fā)的影響

不同溫度條件下JZHB7菌株的孢子萌發(fā)情況見圖3。JZHB7菌株孢子在15 ℃時萌發(fā)率最高,在0 ℃時萌發(fā)率最低。在0~15 ℃隨溫度升高孢子萌發(fā)顯著增多,在15~35 ℃隨溫度升高孢子萌發(fā)顯著減少,說明高溫抑制孢子的萌發(fā),4個溫度條件下孢子萌發(fā)率差異均顯著(P<0.05,SPSS)。

2.4培養(yǎng)時間對菌絲生長的影響

在25 ℃時JZHB7菌落的生長狀況見圖4-圖8。從圖4可看出,JZHB7菌絲在4~7 d生長較快, 10~13 d生長較慢, 4個測量時間的菌落直徑差異均顯著(P<0.05,SPSS)。

2.5不同光照對產(chǎn)孢的影響

JZHB7菌株用豆芽培養(yǎng)基培養(yǎng)9 d后用40 W紫外燈及40 W日光燈分別照射1、2、8、24 h, 觀察對產(chǎn)孢量的影響(圖9)。JZHB7菌株在紫外燈照射下產(chǎn)孢量遠低于日光燈,兩者差異顯著(P<0.05, SPSS)。日光燈照射2 h時產(chǎn)孢最多, 照射24 h產(chǎn)孢最少,但產(chǎn)孢量差異不顯著(P>0.05, SPSS)。比較兩種光源對黑斑病菌產(chǎn)孢的促進效能,顯然日光燈要高于紫外燈。

3小結(jié)與討論

張?zhí)煊頪4]研究表明,部分鏈格孢不同種間菌絲形態(tài)的差異小,只有在菌絲產(chǎn)生一些特殊結(jié)構(gòu)時才有分類學(xué)上的鑒別價值;鏈格孢屬不同種之間在菌落形態(tài)、生長速度等方面常有差別,菌落作為種級鑒別特征對個別種有參考價值。在本研究過程中,12種蘿卜黑斑病菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d,可以較為明顯地觀察到菌絲的生長形態(tài)和變化,20 d后通過顯微鏡可以較為方便地統(tǒng)計鏈格孢的產(chǎn)孢數(shù)量, JZHB7菌株在12個菌株中產(chǎn)孢量最高。

肖長坤等[5]篩選出適合黑斑病菌生長的PDA、PSA和SNA 3種培養(yǎng)基,其中在PDA培養(yǎng)基上供試菌株生長速率均比較快,因此PDA培養(yǎng)基是一種適宜用來大量培養(yǎng)黑斑病菌菌絲體的培養(yǎng)基,這也與已有的相關(guān)報道結(jié)果一致;SNA培養(yǎng)基同樣適宜培養(yǎng),其具有一定的種間選擇性和促進產(chǎn)孢的作用,適合用于病原菌分離、純化和鑒定[6]。

對于鏈格孢的適宜培養(yǎng)基已有類似報道[7]。本研究發(fā)現(xiàn)鏈格孢JZHB7在多種培養(yǎng)基上能生長,不同的培養(yǎng)基上菌絲生長速率以及菌落形態(tài)有較大差異,其中,在豆芽培養(yǎng)基上生長最好,產(chǎn)孢量最大。

JZHB7菌株在0~35 ℃范圍內(nèi)孢子均可萌發(fā);最適孢子萌發(fā)溫度為15 ℃,此時萌發(fā)率最高;0 ℃時萌發(fā)率最低;15~35 ℃孢子萌發(fā)率隨溫度上升而降低。這與前人[8-11]的研究結(jié)果相似。

JZHB7菌株培養(yǎng)4~7 d生長較快, 10~13 d生長較慢。這與已有的研究結(jié)果[12]基本相符。

紫外燈照射不利于JZHB7產(chǎn)孢,日光燈照射2 h產(chǎn)孢最多, 24 h產(chǎn)孢最少。

參考文獻:

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[6] 閻淑娟,董金皋,樊幕貞.白菜黑斑病菌營養(yǎng)生長與毒素產(chǎn)生關(guān)系的初步研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1998,21(1):23-26.

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[11] 范曉龍,朱建華,周旭,等.南方紅豆杉炭疽病病原鑒定及其生物學(xué)特性[J].福建林學(xué)院學(xué)報,2006,26(2):117-122.

[12] 肖長坤,吳學(xué)宏,李健強.白菜黑斑病菌三個種菌株基本培養(yǎng)條件比較[J].菌物學(xué)報,2004,23(4):573-579.

2.3溫度對孢子萌發(fā)的影響

不同溫度條件下JZHB7菌株的孢子萌發(fā)情況見圖3。JZHB7菌株孢子在15 ℃時萌發(fā)率最高,在0 ℃時萌發(fā)率最低。在0~15 ℃隨溫度升高孢子萌發(fā)顯著增多,在15~35 ℃隨溫度升高孢子萌發(fā)顯著減少,說明高溫抑制孢子的萌發(fā),4個溫度條件下孢子萌發(fā)率差異均顯著(P<0.05,SPSS)。

2.4培養(yǎng)時間對菌絲生長的影響

在25 ℃時JZHB7菌落的生長狀況見圖4-圖8。從圖4可看出,JZHB7菌絲在4~7 d生長較快, 10~13 d生長較慢, 4個測量時間的菌落直徑差異均顯著(P<0.05,SPSS)。

2.5不同光照對產(chǎn)孢的影響

JZHB7菌株用豆芽培養(yǎng)基培養(yǎng)9 d后用40 W紫外燈及40 W日光燈分別照射1、2、8、24 h, 觀察對產(chǎn)孢量的影響(圖9)。JZHB7菌株在紫外燈照射下產(chǎn)孢量遠低于日光燈,兩者差異顯著(P<0.05, SPSS)。日光燈照射2 h時產(chǎn)孢最多, 照射24 h產(chǎn)孢最少,但產(chǎn)孢量差異不顯著(P>0.05, SPSS)。比較兩種光源對黑斑病菌產(chǎn)孢的促進效能,顯然日光燈要高于紫外燈。

3小結(jié)與討論

張?zhí)煊頪4]研究表明,部分鏈格孢不同種間菌絲形態(tài)的差異小,只有在菌絲產(chǎn)生一些特殊結(jié)構(gòu)時才有分類學(xué)上的鑒別價值;鏈格孢屬不同種之間在菌落形態(tài)、生長速度等方面常有差別,菌落作為種級鑒別特征對個別種有參考價值。在本研究過程中,12種蘿卜黑斑病菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d,可以較為明顯地觀察到菌絲的生長形態(tài)和變化,20 d后通過顯微鏡可以較為方便地統(tǒng)計鏈格孢的產(chǎn)孢數(shù)量, JZHB7菌株在12個菌株中產(chǎn)孢量最高。

肖長坤等[5]篩選出適合黑斑病菌生長的PDA、PSA和SNA 3種培養(yǎng)基,其中在PDA培養(yǎng)基上供試菌株生長速率均比較快,因此PDA培養(yǎng)基是一種適宜用來大量培養(yǎng)黑斑病菌菌絲體的培養(yǎng)基,這也與已有的相關(guān)報道結(jié)果一致;SNA培養(yǎng)基同樣適宜培養(yǎng),其具有一定的種間選擇性和促進產(chǎn)孢的作用,適合用于病原菌分離、純化和鑒定[6]。

對于鏈格孢的適宜培養(yǎng)基已有類似報道[7]。本研究發(fā)現(xiàn)鏈格孢JZHB7在多種培養(yǎng)基上能生長,不同的培養(yǎng)基上菌絲生長速率以及菌落形態(tài)有較大差異,其中,在豆芽培養(yǎng)基上生長最好,產(chǎn)孢量最大。

JZHB7菌株在0~35 ℃范圍內(nèi)孢子均可萌發(fā);最適孢子萌發(fā)溫度為15 ℃,此時萌發(fā)率最高;0 ℃時萌發(fā)率最低;15~35 ℃孢子萌發(fā)率隨溫度上升而降低。這與前人[8-11]的研究結(jié)果相似。

JZHB7菌株培養(yǎng)4~7 d生長較快, 10~13 d生長較慢。這與已有的研究結(jié)果[12]基本相符。

紫外燈照射不利于JZHB7產(chǎn)孢,日光燈照射2 h產(chǎn)孢最多, 24 h產(chǎn)孢最少。

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