李家敏+姜瓊+汪劍鳴

摘要:采用改良CTAB法提取廣東紫珠(Callicarpa kwangtungensis Chun.)植物總DNA,以通用引物ITS4和ITS5 PCR擴(kuò)增核糖體DNA ITS序列,并運(yùn)用MEGA5.2軟件分析ITS序列和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明,廣東紫珠的核糖體DNA ITS序列長度為658 bp,ITS1和 ITS2的長度分別為229、267 bp,G+C含量分別為67.39%、70.30%。用NJ法根據(jù)ITS1與ITS2序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,ITS片段在種間存在差異,可區(qū)分紫珠屬中不同的種。測(cè)序分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建,能夠?qū)V東紫珠進(jìn)行準(zhǔn)確的分子鑒定,為紫珠屬中藥材的種類鑒定和種間的分類地位提供分子生物學(xué)理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞:廣東紫珠(Callicarpa kwangtungensis Chun.);ITS序列;分子鑒定

中圖分類號(hào):Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2014)10-2435-05

Identification of Callicarpa kwangtungensis Chun. with ITS Sequences

of Nuclear Ribosomal DNA

LI Jia-min,JIANG Qiong,WANG Jian-ming

(College of Chemical and Biological Engineering,Yichun University,Yichun 336000,Jiangxi,China)

Abstract: To identify C.kwangtungensis Chun. with ITS of rDNA, the total DNA of the sample was extracted with modified CTAB. The ITS of rDNA was amplified using a pair of primers ITS4 and ITS5 then was cloned, sequenced and analyzed by MEGA5.2. The results showed that the length of ITS of rDNA was 658 bp. The DNA sequence of ITS4 was 229 bp with the content of G+C of 67.39%. The DNA sequence of ITS5 was 267 bp with the content of G+C of 70.30%.The phylogenetic tree based on ITS data was constructed. Molecular identification could be performed on Callicarpa kwangtungensis Chun. It will provid molecular evidence for taxonomy and identification of different species of Callicarpa.

Key words: Callicarpa kwangtungensis Chun.;ITS sequences;molecular identification

基金項(xiàng)目:江西省教育廳青年基金項(xiàng)目(GJJ10252);江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目

廣東紫珠(Callicarpa kwangtungensis Chun.)為馬鞭草科紫珠亞屬多年生落葉植物,適合生長于海拔100~1 000 m的丘陵山地,主要分布于江西、湖南、福建、貴州等省,廣東和廣西等地也有少量分布。廣東紫珠的干燥莖、枝、葉均可入藥,具有收斂止血、清熱解毒等功效,收載于《中國藥典》(2010年版),可用于治療咯血、便血、肺胃出血、崩漏、肺熱咳嗽、咽喉腫痛、燒傷、熱毒瘡、外傷出血等?；瘜W(xué)成分研究表明,廣東紫珠富含熊果酸、槲皮素、沒食子酸、水楊酸等化學(xué)成分[1];藥理研究顯示具有較強(qiáng)的抑菌作用和顯著的止血效果[2],臨床上廣東紫珠主要用于治療宮頸糜爛出血、陰道炎、宮頸炎等,是抗宮炎片、抗宮炎顆粒和抗宮炎膠囊等中成藥的主要成分[3]。目前,市場(chǎng)上對(duì)廣東紫珠資源需求量很大,原料藥材供不應(yīng)求,由于大量采挖,野生資源銳減,且遭到嚴(yán)重破壞,加上野生藥材質(zhì)量難以控制,野生資源已不能滿足社會(huì)需求,對(duì)廣東紫珠進(jìn)行資源鑒定和育種成為解決這一問題的關(guān)鍵。準(zhǔn)確鑒定廣東紫珠有利于指導(dǎo)其育種,因此,有必要在DNA分子水平上鑒定廣東紫珠與其他紫珠屬植物的種間關(guān)系。ITS(Internal transcribed spacer,ITS)序列是核糖體DNA轉(zhuǎn)錄單位的一部分,包括了ITS1、ITS2和5.8S rDNA基因,在被子植物中ITS序列既具有核苷酸序列的保守性和高度變異性。ITS序列分析是近年來國際上植物多樣性研究的熱點(diǎn),并在藥用植物種質(zhì)資源研究中得到廣泛應(yīng)用,如藥用植物品種的鑒定、親緣關(guān)系鑒定、藥用植物分類、遺傳多樣性、藥用植物DNA條形碼分析等[4]。本研究采用ITS序列標(biāo)記對(duì)廣東紫珠的核糖體DNA ITS序列進(jìn)行分子鑒定,構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹,從DNA水平上為廣東紫珠的地位分類和種間鑒定提供分子證據(jù)和為廣東紫珠的選育提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

廣東紫珠于2013年3月采集自江西省宜春市,經(jīng)宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院汪劍鳴教授鑒定為馬鞭草科紫珠屬廣東紫珠,保存于江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2主要試劑與儀器

NaCl、CTAB、EDTA、Tris、氯仿、異戊醇、異丙醇均為分析純,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,PCR反應(yīng)試劑購自于寶生物工程(大連)有限公司?？侰TAB提取緩沖液為2.5 mol/L NaCl、2% CTAB(W/V)、0.05 mol/L EDTA、0.1 mol/L Tris[5]。

超低溫冰箱(7010702)、水浴鍋(HH-4)、離心機(jī)(Eppendorf-G5415R)、XP基因擴(kuò)增儀(BYQ602101-174)、雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀(DYY-6C)、紫外分光光度計(jì)(UV-2000)、凝膠成像系統(tǒng)(Gel Media System)。

1.3方法

1.3.1廣東紫珠總DNA的提取新鮮幼嫩葉片,清水沖洗,后以體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇消毒,去離子水沖洗3次,于-80 ℃冰箱保存。取0.2 g葉片組織用液氮研磨成粉末,放入1.5 mL離心管中;加入600 μL 65 ℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液,輕輕搖勻,65 ℃水浴60 min,期間輕晃3次;再加700 μL氯仿-異戊醇(體積比24∶1),輕輕顛倒混勻10 min,10 000 r/min離心10 min,轉(zhuǎn)移上清液至另一新管中;加入等體積-20 ℃預(yù)冷的異丙醇混勻,-20 ℃放置30 min,10 000 r/min離心15 min,棄上清液,70%的乙醇沉淀,無水乙醇洗滌,室溫?fù)]干乙醇;以去離子水在4 ℃下溶解DNA,-20 ℃保存。

1.3.2核糖體DNA ITS區(qū)片段的PCR擴(kuò)增采用核糖體DNA ITS序列通用引物擴(kuò)增整個(gè)ITS片段(ITS1-5.8S rDNA-ITS2區(qū)段),ITS4:5′-TCCTCCGC

TTATTGATATGC-3′,ITS5:5′-GGAAGGAGAAGTC

GTAACAAGG-3′[6]。PCR反應(yīng)體系:10×PCR Buffer 5 μL,MgCl2(25 mmol/L)4 μL, dNTPs(2 mmol/L) 5 μL,ITS4與ITS5引物各5 μL(1 μmol/L),Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)1 μL,DNA模板(約70~80 ng)5 μL,ddH2O 20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性4 min;95 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min,PCR產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物用TaKaRa Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction kit Ver.3.0(寶生物工程有限公司)進(jìn)行純化,按照說明書操作。

1.3.3核糖體DNA ITS序列的克隆與測(cè)序?qū)⒓兓蟮腜CR產(chǎn)物克隆至大腸桿菌pMD 18-T載體上,經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選后,將所得菌落接種到LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)上進(jìn)行過夜培養(yǎng),提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并將陽性菌株送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4核糖體DNA ITS序列分析DNA序列使用MEGA5.2軟件進(jìn)行分析,采用Pairwise distances法計(jì)算遺傳距離,采用NJ鄰接法構(gòu)建紫珠屬多個(gè)物種的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹;系統(tǒng)發(fā)育樹各分支的置信度用自舉檢驗(yàn)法(Bootstrap test)檢驗(yàn),共進(jìn)行2 000次循環(huán),以評(píng)價(jià)各分支的系統(tǒng)學(xué)意義與可靠性

2結(jié)果與分析

2.1廣東紫珠總DNA提取結(jié)果

將提取的總DNA稀釋200倍后,取5 μL樣品,以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果如圖1所示。不同樣本DNA的電泳帶均有清晰明確的目的條帶,無降解現(xiàn)象,樣本DNA質(zhì)量比較穩(wěn)定。

2.2 核糖體DNA ITS PCR擴(kuò)增結(jié)果

以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶明亮,片段完整,分子量約750 bp左右,與報(bào)道中ITS片段大小相符。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠,并用試劑盒(TaKaRa Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0)進(jìn)行回收。

2.3核糖體DNA ITS序列分析

用MEGA5.2軟件對(duì)核糖體DNA ITS序列進(jìn)行分析,以來源于英國皇家植物園的紫珠屬植物Callicarpa japonica的核糖體DNA ITS序列(FM163230)作為參比序列,進(jìn)行序列拼接,結(jié)果如圖3所示。廣東紫珠的核糖體DNA ITS片段長度為658 bp,ITS1長為229 bp,G+C含量為67.39%;5.8S rDNA長為162 bp;ITS2長為267 bp,G+C含量為70.30%。

由于5.8S rDNA序列比較保守,本研究僅分析ITS序列。將樣本的ITS序列與在GenBank中已提交的紫珠屬物種的ITS序列(表1)進(jìn)行多序列BLAST比對(duì)分析。多序列同源比對(duì)后的ITS長度為513 bp,保守位點(diǎn)為428個(gè),占83.43%;變異位點(diǎn)76個(gè),占14.84%,序列比對(duì)中Callicarpa japonica的核糖體DNA ITS序列與其他物種的ITS序列出現(xiàn)9 bp缺失(圖4);簡約信息位點(diǎn)25個(gè),占4.87%,單個(gè)位點(diǎn)50個(gè),占9.75%。ITS1的變異位點(diǎn)為32個(gè),簡約信息位點(diǎn)數(shù)為12個(gè),ITS2的變異位點(diǎn)數(shù)44個(gè),簡約信息位點(diǎn)數(shù)13個(gè)。本試驗(yàn)結(jié)果與厚樸的ITS序列變異趨于一致[7]。從序列比對(duì)可見,ITS序列發(fā)生了堿基的替換,ITS2發(fā)生次數(shù)更多,同時(shí)在ITS2區(qū)域,發(fā)生了堿基的1個(gè)、3個(gè)、4個(gè)的缺失,而ITS1出現(xiàn)缺失相對(duì)少。可見,就變異位點(diǎn)而言,ITS2序列所含信息量高于ITS1。

2.4基于ITS序列的紫珠屬親緣關(guān)系分析

由于核糖體DNA ITS中ITS1和ITS2兩個(gè)片段長度有限,各自提供的信息量有限,因此,多數(shù)研究者將兩個(gè)片段綜合起來分析。因此,將樣本廣東紫珠的ITS序列與紫珠屬物種的ITS序列通過序列對(duì)比,利用MEGA 5.2軟件基于Pairwise distances(p-distances)計(jì)算樣本的遺傳距離如表2所示。11個(gè)紫珠屬樣本的遺傳距離介于0.022~0.088,廣東紫珠與日本紫珠(FM163230)的遺傳距離最近,為0.028,與Callicarpa pentandra(FM163237)的遺傳距離最遠(yuǎn),為0.080。

根據(jù)樣本的ITS序列采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖5所示,11個(gè)樣本被分為兩支。一支為木紫珠(FM163233)、Callicarpa pentandra(FM163237)與白毛紫珠(AF478942)聚為一支,另一支由8個(gè)種組成,其中紅紫珠(FM163231)、老鴉糊(FJ593347)、日本紫珠(FM163230)被聚為一支,然后廣東紫珠再與其聚為一亞支;狹葉紅紫珠(FM163240)、大葉紫珠(FM163246)、長葉紫珠(FM163252)聚為一亞支;白棠子樹(FM163242)與以上兩亞支聚為一支,說明以上紫珠屬種的遺傳距離相近,從分子水平上支持了廣東紫珠的分類地位。

3小結(jié)與討論

核糖體DNA ITS序列能成為被子植物系統(tǒng)與進(jìn)化研究中的重要分子標(biāo)記。 ITS片段作為18S~26S rDNA的一個(gè)組成部分在核基因組中是高度重復(fù)的,通過不等交換和基因轉(zhuǎn)換,不同ITS拷貝間的序列趨于相近或完全一致,為PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序奠定了理論基礎(chǔ)[8]。ITS1和ITS2作為非編碼區(qū),承受的選擇壓力較小,其長度保守,但核苷酸序列變化大,可提供詳盡的遺傳學(xué)信息[9],同時(shí)ITS序列長度比較穩(wěn)定,包括5.8S rDNA在內(nèi),總長度只有600~700 bp,為測(cè)序帶來了很大方便。核糖體DNA ITS已被廣泛地應(yīng)用到中藥植物的鑒定研究中,如當(dāng)歸、牛蒡子、鉤藤等中藥植物的鑒定[10-12]。

廣東紫珠的ITS序列片段總長為658 bp,其中G+C含量較高,相同現(xiàn)象出現(xiàn)在柳屬物種上[13];ITS的變異位點(diǎn)中,ITS2變異位點(diǎn)比例、信息量高于ITS1,結(jié)論與不同產(chǎn)區(qū)厚樸的ITS序列分析結(jié)果一致[7];在紫珠屬物種中ITS1、ITS2的變異都有堿基替換外,但I(xiàn)TS2還出現(xiàn)多個(gè)堿基缺失,ITS2片段的差異可用于紫珠屬種間鑒定。

根據(jù)植物形態(tài)區(qū)分,廣東紫珠與日本紫珠(FM163230)屬于紫珠亞屬的孔裂藥系,其他9個(gè)樣本屬于縱裂藥系。基于ITS基因序列的系統(tǒng)聚類而言,廣東紫珠與日本紫珠遺傳距離最近,聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類不一致,可作為廣東紫珠系統(tǒng)發(fā)育的支持。作為重要原料藥,廣東紫珠資源不足,市場(chǎng)上采用大葉紫珠(FM163246)代替,兩者在形態(tài)上有一定差異[14],ITS序列分析結(jié)果表明,兩者遺傳距離0.038,聚類分析不在一分支,表明采用ITS序列能很好將兩者分開,但僅根據(jù)憑ITS序列研究紫珠屬種系關(guān)系是不夠全面的,有關(guān)其系統(tǒng)分類與親緣關(guān)系的研究尚結(jié)合其他DNA分析手段做出更科學(xué)的評(píng)價(jià)。

致謝:本研究得到江西省普通本科高校中青年教師發(fā)展計(jì)劃訪問學(xué)者專項(xiàng)支持,中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院陸續(xù)博士在數(shù)據(jù)分析中給予指導(dǎo),在此一并致謝。

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