楊麗華，査金苗，王子健

中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境水質(zhì)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085

乙烯菌核利對(duì)稀有鮈鯽性腺組織及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

楊麗華，査金苗*，王子健

中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境水質(zhì)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085

乙烯菌核利在哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被廣泛證實(shí)具有抗雄激素效應(yīng)，而對(duì)魚(yú)類的研究結(jié)論目前并不統(tǒng)一。將性成熟稀有鮈鯽分別暴露于0、2、10、50 μg·L-1乙烯菌核利21 d，研究環(huán)境濃度下乙烯菌核利對(duì)魚(yú)類生殖系統(tǒng)的影響及作用機(jī)制。結(jié)果表明，雌魚(yú)的性腺指數(shù)(GSI)、肝臟指數(shù)(HSI)在所有濃度組均顯著降低(p<0.05)，同時(shí)卵巢組織中卵泡的發(fā)育受到了抑制；而雄魚(yú)僅HSI在最高濃度組(50 μg·L-1)出現(xiàn)顯著降低(p<0.05)，精巢組織切片也未觀察到明顯損傷，說(shuō)明乙烯菌核利對(duì)雌魚(yú)生殖系統(tǒng)的影響大于雄魚(yú)。在轉(zhuǎn)錄水平上，雌魚(yú)性腺中er mRNA、vtg mRNA分別在50 μg·L-1和10、50 μg·L-1時(shí)顯著升高(p<0.05)，ar mRNA在所有濃度組顯著升高(p<0.05)；而雄魚(yú)性腺中ar mRNA、dmrt1 mRNA水平分別在10 μg·L-1濃度組和所有濃度組顯著降低(p<0.05)，er mRNA在所有濃度組顯著降低(p<0.05)，說(shuō)明雌雄魚(yú)對(duì)乙烯菌核利暴露的分子響應(yīng)機(jī)制存在差異。綜上，環(huán)境濃度下乙烯菌核利短期暴露會(huì)對(duì)稀有鮈鯽生殖系統(tǒng)產(chǎn)生一定的影響，并且雌雄魚(yú)在敏感性和分子響應(yīng)機(jī)制上都存在差異。

乙烯菌核利；稀有鮈鯽；性腺組織；轉(zhuǎn)錄

乙烯菌核利(vinclozolin)，又稱灰霉利、烯菌酮，商品名為農(nóng)利靈，其化學(xué)名稱為3-(3,5-二氯苯基)-5-甲基-5-乙烯基-1,3-噁唑烷-2,4-二酮，結(jié)構(gòu)式為：在結(jié)構(gòu)上，乙烯菌核利屬于3,5-二氯苯胺的衍生物，即二甲酰亞胺類殺菌劑。它是一種廣譜的保護(hù)性和觸殺性殺菌劑，廣泛用于蔬菜和水果的生產(chǎn)過(guò)程。農(nóng)田中施用的乙烯菌核利可遷移至地表水，幾周甚至數(shù)月后仍能夠檢測(cè)到[1]。Steeger和Garber[2]通過(guò)模型預(yù)測(cè)乙烯菌核利在水體中最高濃度可能達(dá)到52.0 μg·L-1；Oskam等[3]在萊茵河中檢測(cè)到的乙烯菌核利的濃度為2.4 μg·L-1。水體中的乙烯菌核利可部分吸附于懸浮顆粒物或沉積物，其生物富集因子(BCF)介于60～1 260之間，可在水生生物體內(nèi)富集。

乙烯菌核利曾被認(rèn)為是對(duì)野生生物低毒的[1]，但越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)它會(huì)干擾生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)，且已經(jīng)被列入歐盟優(yōu)先污染物名單[4]和美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局(USEPA)2009年公布的飲用水污染物候選清單(CCL3)[5]。大量研究表明，乙烯菌核利可干擾雄激素受體信號(hào)通路[6]，特別是抑制雄激素依賴性基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因編碼的產(chǎn)物對(duì)雄性性功能如求偶行為及精子發(fā)生有重要意義[7-8]。胚胎期乙烯菌核利暴露可以影響哺乳動(dòng)物的性別分化及性別決定(如抑制生精小管索形成)，并導(dǎo)致青春期及成年雄性動(dòng)物出現(xiàn)睪丸萎縮、前列腺重量降低[9]，精子細(xì)胞凋亡增加等[10]。乙烯菌核利對(duì)魚(yú)類的影響主要集中于雄魚(yú)的性腺分化和精巢發(fā)育等，且結(jié)論并不統(tǒng)一。如Baatrup和Junge[11]發(fā)現(xiàn)乙烯菌核利可以抑制雄性虹鳉(Poecilia reticulate)精巢發(fā)育，并影響其第二性征(吸引異性的橘黃色區(qū)域減小)及求偶行為；而Makynen等[12]發(fā)現(xiàn)乙烯菌核利對(duì)黑頭呆魚(yú)(Pimephales promelas)幼魚(yú)的性別分化無(wú)顯著影響，與雄激素受體(AR)的親和力也較低。Martinovic等[13]對(duì)黑頭呆魚(yú)(Pimephales promelas)的研究表明，乙烯菌核利對(duì)雌魚(yú)性腺的影響大于雄魚(yú)。上述研究均采用了較高劑量的暴露水平(高達(dá)1 200 μg·L-1)，其結(jié)果難以用于評(píng)價(jià)環(huán)境中乙烯菌核利的毒性效應(yīng)和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。因此，需要進(jìn)一步研究環(huán)境濃度水平下乙烯菌核利對(duì)魚(yú)類生殖系統(tǒng)的影響及作用機(jī)制。

稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)，俗名金白娘、墨線魚(yú)，隸屬于鯉形目，鯉科，(魚(yú)丹)亞科，鮈鯽屬，具有性成熟快、繁殖力強(qiáng)、產(chǎn)卵頻次高、飼養(yǎng)方便、實(shí)驗(yàn)操作容易、溫度適應(yīng)廣、對(duì)化學(xué)品敏感且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用到化學(xué)品測(cè)試及毒理學(xué)研究領(lǐng)域[14]。以往研究已經(jīng)證實(shí)，稀有鮈鯽性腺相關(guān)基因，如雌激素受體(estrogen receptor, er)、卵黃蛋白原(vitellogenin, vtg)、雄激素受體(androgen receptor, ar)、dmrt1(Doublesex and Mab-3 related transcription factor 1)等對(duì)外源污染物的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)具有很好的指示作用[15]。因此，本研究的主要目的是以性成熟稀有鮈鯽為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，從組織、轉(zhuǎn)錄等不同水平上揭示環(huán)境濃度水平下乙烯菌核利對(duì)不同性別稀有鮈鯽性腺的影響及分子機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)飼養(yǎng)

稀有鮈鯽由本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)并繁殖后代多年，至少馴化7代以上。養(yǎng)殖用水為經(jīng)活性炭過(guò)濾并曝氣的自來(lái)水(pH 7.2～7.6；硬度 44.0～61.0 mg·L-1，以CaCO3計(jì))，水溫控制在(25±1) ℃，光周期為16 h∶8 h (晝∶夜)，溶解氧不低于7 mg·L-1。飼養(yǎng)期每天投喂飼料3次，即小顆粒商品餌料(TetraMin?)2次和剛孵化的豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)(Artemia nauplii)1次，并及時(shí)清除多余餌料和排泄物。

1.2 材料與試劑

乙烯菌核利(純度>99.5%)購(gòu)自美國(guó)Supelco Chemical公司，助溶劑二甲基亞砜(DMSO)(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Sigma Chemical公司。逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV RT)、脫氧核糖核苷酸(dNTP)等為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；RNAprep動(dòng)物總RNA提取試劑盒(含DNase I)購(gòu)自天根生化科技公司；SYBR Green PCR master mix購(gòu)自美國(guó)Stratagene公司。其他常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 流水暴露實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)選取來(lái)自同親本的性成熟稀有鮈鯽，隨機(jī)分為5組(每組30條，性別比為1∶1)，試驗(yàn)開(kāi)始前馴養(yǎng)1周。

暴露實(shí)驗(yàn)采用流水系統(tǒng)完成，具體操作如下：將乙烯菌核利配制成不同濃度的暴露母液(DMSO助溶)，用蠕動(dòng)泵將暴露母液泵入(1.0 mL·min-1)，與去氯自來(lái)水(4 L·h-1)混合后注入暴露缸(18 L)，乙烯菌核利的終濃度分別為2、10、50 μg·L-1；同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、溶劑對(duì)照，且暴露組和溶劑對(duì)照組中助溶劑的終濃度均不超過(guò)0.01‰(體積分?jǐn)?shù))。乙烯菌核利暴露濃度的選擇依據(jù)如下：以模型預(yù)測(cè)最大濃度為上限[2]，包含水環(huán)境中的實(shí)際報(bào)道濃度[3]，等比例設(shè)置。暴露過(guò)程中pH=7.2～7.6，硬度為44.0～61.0 mg·L-1(以CaCO3計(jì))，水溫控制在(25±1) ℃，光照周期為16 h∶8 h(晝∶夜)，溶解氧不低于7 mg·L-1。每天投喂小顆粒商品餌料(TetraMin?)1次和剛孵化的豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)(Artemia nauplii)2次，并及時(shí)清除多余餌料和排泄物。

暴露時(shí)間為28 d，暴露結(jié)束前一天晚上停止喂食，使試驗(yàn)魚(yú)空腹。解剖之前首先使用冰塊麻醉，并用濾紙吸干，稱量并記錄體長(zhǎng)和體重。然后解剖取性腺、肝臟，稱量后存放于-80 ℃待測(cè)。

1.4 形態(tài)學(xué)指標(biāo)分析

各形態(tài)學(xué)指標(biāo)的計(jì)算方法如下：

條件因子K-factor = 體重(g)/體長(zhǎng)(cm)3×100

性腺指數(shù)GSI = 性腺重量(g)/體重(g)×100

肝臟指數(shù)HSI = 肝臟重量(g)/體重(g)×100

1.5 組織切片

分離的組織在Bouin's液中固定24 h后，轉(zhuǎn)移至70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，按常規(guī)程序脫水、石蠟包埋，切片機(jī)切片，切片厚度3～4 μm，蘇木精和曙紅染色(H&E染色)。切片觀察分析使用Axioskop 2 mot plus光學(xué)顯微鏡和AxioVision Rel. 4.5 軟件(Zeiss, Oberkochen, Germany)。

1.6 熒光定量PCR

雌雄魚(yú)性腺組織總RNA提取按照天根生化RNAprep動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并加入DANase I去除DNA污染。1.2%(質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳(0.5× TBE buffer, 150 V, 15 min)檢測(cè)RNA完整性，UV-2000紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(Unico, Dayton, USA)測(cè)定RNA濃度及純度。取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，SYBR Green I染料法對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行定量檢測(cè)(Mx3005P, Stratagene, USA)。反應(yīng)體系均為25 μL，包括SYBR Green PCR master mix (Stratagene, USA) 11.25 μL，25 μmol·L-1正義和反義引物各0.4 μL及cDNA 1 μL和ddH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；40個(gè)循環(huán)：95 ℃變性30 s，58 ℃復(fù)性40 s，72 ℃延伸30 s；最后一個(gè)循環(huán)做熔解曲線：95 ℃變性60 s，58 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s。內(nèi)參基因選擇β-actin，引物如下：正義引物5'-CAGGGCGTGATGG TGGGGAT-3'，反義引物5'-GGTTGGCTTTGGGGTTGAG -3'。各目標(biāo)基因引物見(jiàn)表1。

所有樣品的定量檢測(cè)至少重復(fù)2次，每次2個(gè)平行。以delta-delta Ct法計(jì)算目標(biāo)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

所有的數(shù)據(jù)分析均通過(guò)SPSS 13.0(SPSS, Chicago, IL, USA)軟件one-way ANOVA方法，Levene方法驗(yàn)證方差齊次性，Dunnett's方法分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間差異顯著性，顯著性水平為p<0.05；結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，作圖使用Origin 8.0軟件完成。

表1 定量PCR所用引物信息Table 1 Primers for q-RT-PCR utilized in this study

2 結(jié)果(Results)

2.1 形態(tài)學(xué)指標(biāo)的變化

稀有鮈鯽的形態(tài)學(xué)指標(biāo)變化見(jiàn)表2。經(jīng)乙烯菌核利暴露28 d后，稀有鮈鯽體長(zhǎng)及體重(數(shù)據(jù)未給出)和條件因子與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯的差異。雌魚(yú)的性腺指數(shù)、肝臟指數(shù)在所有濃度組均顯著降低(p<0.05)，而雄魚(yú)僅肝臟指數(shù)在最高濃度組出現(xiàn)顯著降低(p<0.05)。

2.2 組織病理學(xué)損傷

稀有鮈鯽性腺組織切片見(jiàn)圖1。對(duì)照組稀有鮈鯽卵巢中以成熟卵母細(xì)胞(第V時(shí)相)為主，有少量Ⅱ、 Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞(圖1A)；而在50 μg·L-1乙烯菌核利暴露組稀有鮈鯽卵巢中則以第Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞為主，還有一定數(shù)量的第Ⅲ 、 Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞及少量的成熟卵母細(xì)胞(圖1B)。

對(duì)照組稀有鮈鯽精巢內(nèi)可觀察到成熟的精子(spermatozoa, SP)及不同發(fā)育階段的精小囊(spermatogenic cyst, SPC)，分別含有精原細(xì)胞(spermatogonia, SG)和精母細(xì)胞(spermatocyte, SC)等(圖1C)。乙烯菌核利暴露組的精巢與對(duì)照組相似且發(fā)育良好(圖1D)。

表2 乙烯菌核利(VCZ)對(duì)稀有鮈鯽形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響Table 2 Impacts of vinclozolin (VCZ) on morphometric parameters of rare minnow (Gobiocypris rarus)

注：Mean±SEM (n = 15)；*表示與對(duì)照組相比具有顯著差異(p<0.05)。

Note: Mean±SEM (n = 15); * p<0.05, compared with the control.

圖1 稀有鮈鯽性腺組織切片注：A，對(duì)照組雌魚(yú)(40×)；B，50 μg·L-1 VCZ暴露后雌魚(yú)(40×)；C，為對(duì)照組雄魚(yú)(200×)；D，50 μg·L-1 VCZ暴露后雄魚(yú)(200×)。 Ⅱ , Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ分別代表第Ⅱ , Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ時(shí)相的卵母細(xì)胞，SPC，精小囊；SG，精原細(xì)胞；SC，精母細(xì)胞；SP，精子。Fig. 1 Microphotographs of gonad from rare minnow (Grobiocypris rarus)Note: A, gonad from female control (40×); B, gonad from female fish exposed to 50 μg·L-1 VCZ (40×); C, gonad from male control (200×); D, gonad from male fish exposed to 50 μg·L-1 VCZ (200×); Ⅱ , Ⅲ, Ⅳ, Ⅴindicate oocyte at Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ stage, respectively; SPC, spermatogenic cyst; SG, spermatogonia; SC, spermatocyte; SP, spermatozoa.

2.3 性腺基因轉(zhuǎn)錄水平的變化

稀有鮈鯽性腺er、vtg、ar、dmrt1基因轉(zhuǎn)錄水平變化情況見(jiàn)圖2和圖3。暴露于乙烯菌核利28 d后，雌魚(yú)性腺中er、vtg的轉(zhuǎn)錄水平分別在50 μg·L-1和10、50 μg·L-1時(shí)顯著升高(p<0.05)；ar轉(zhuǎn)錄水平在所有濃度組顯著升高(p<0.05)，但dmrt1轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)生顯著變化(圖2)。雄魚(yú)中，er mRNA水平顯著降低(p<0.05)，vtg mRNA無(wú)顯著變化；ar mRNA、dmrt1 mRNA水平分別在10 μg·L-1濃度組和所有濃度組顯著降低(p<0.05) (圖3)。

圖2 乙烯菌核利暴露對(duì)雌性稀有鮈鯽性腺相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響注：與對(duì)照組相比，* p<0.05，** p<0.01，下同。Fig. 2 Effect of vinclozolin on gene transcription in gonad of female rare minnow (Grobiocypris rarus)Note: * p<0.05, ** p<0.01, compared with the control, the same below.

圖3 乙烯菌核利暴露對(duì)雄性稀有鮈鯽性腺相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig. 3 Effect of vinclozolin on gene transcription in gonad of male rare minnow (Grobiocypris rarus)

3 討論(Discussion)

通過(guò)組織及基因轉(zhuǎn)錄等水平的研究發(fā)現(xiàn)，乙烯菌核利短期暴露會(huì)對(duì)稀有鮈鯽性腺組織發(fā)育和功能產(chǎn)生一定的干擾，并且在雌雄魚(yú)體內(nèi)表現(xiàn)出不同的作用機(jī)制。

條件因子和組織指數(shù)可以從一定程度上反映魚(yú)類整體狀況或組織生長(zhǎng)狀態(tài)，且易于測(cè)量與計(jì)算，因此廣泛用于毒理學(xué)研究中[16]。如Deng等[17]研究發(fā)現(xiàn)，成年斑馬魚(yú)(Danio rerio)暴露于三溴苯酚之后，條件因子顯著增加。本研究中，雌雄魚(yú)條件因子與對(duì)照組相比均未發(fā)生明顯變化。然而，組織指數(shù)則受到了顯著影響，特別是在雌魚(yú)體內(nèi)，即使在最低濃度組(2 μg·L-1)HSI和GSI也出現(xiàn)了顯著的降低。哺乳動(dòng)物研究表明，乙烯菌核利的確會(huì)對(duì)卵巢的發(fā)育有不利影響[18]。Makynen等[12]研究表明，暴露于高濃度乙烯菌核利(700 μg·L-1) 21 d后，雌性黑頭呆魚(yú)(Pimephales promelas)的性腺指數(shù)顯著下降，但暴露于200 μg·L-1乙烯菌核利并未導(dǎo)致雌性黑頭呆魚(yú)的性腺指數(shù)發(fā)生顯著變化。而本研究中，即使在2 μg·L-1乙烯菌核利暴露組，雌性稀有鮈鯽的GSI也發(fā)生了顯著變化，這可能與實(shí)驗(yàn)魚(yú)類的敏感性和暴露時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。同時(shí)在Makynen等[12]的研究中，乙烯菌核利的暴露未對(duì)雄魚(yú)GSI產(chǎn)生顯著影響，與本研究結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)乙烯菌核利的短期暴露對(duì)成年稀有鮈鯽的整體生長(zhǎng)沒(méi)有顯著的影響，但是會(huì)對(duì)肝臟、性腺等組織造成損害。

組織病理學(xué)結(jié)果顯示，乙烯菌核利暴露組的雌魚(yú)性腺組織中卵泡的發(fā)育受到了嚴(yán)重抑制，這可能是雌魚(yú)HSI和GSI下降的主要原因。而雄魚(yú)精巢組織在顯微鏡下未觀察到明顯損傷，同時(shí)雄魚(yú)GSI也沒(méi)有顯著變化。Martinovic等[13]在對(duì)黑頭呆魚(yú)(Pimephales promelas)的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象：乙烯菌核利暴露后的雌魚(yú)產(chǎn)卵量減少且卵巢閉鎖發(fā)生率增加，但雄魚(yú)則未表現(xiàn)出明顯的性腺組織損傷。上述結(jié)果均表明，乙烯菌核利對(duì)雌魚(yú)生殖系統(tǒng)的影響大于雄魚(yú)。Bayley等[19]的研究則證實(shí)乙烯菌核利可以影響虹鳉(Poecilia reticulate，未完全性成熟)的生殖能力，而Kiparissis等[20]也在未性成熟青鳉(Oryzias latipes)中發(fā)現(xiàn)乙烯菌核利引起的性腺組織損傷如精巢纖維化。由此推測(cè)，乙烯菌核利對(duì)生殖系統(tǒng)的影響很可能與魚(yú)類的性別以及性腺發(fā)育階段有關(guān)。

為進(jìn)一步了解乙烯菌核利對(duì)稀有鮈鯽生殖系統(tǒng)的影響，分別測(cè)定了雌雄稀有鮈鯽性腺組織中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平。在魚(yú)類體內(nèi)，合成后的雌激素和/或雄激素與相應(yīng)的受體結(jié)合，并激活受體依賴性基因的表達(dá)(如vtg、dmrt1)，從而對(duì)性腺組織的發(fā)育進(jìn)行調(diào)節(jié)[21]。卵黃蛋白原雖然主要來(lái)源于肝臟，但已有研究表明，vtg mRNA在肝臟外組織，特別是卵巢也有表達(dá)，并且可以被雌激素(E2)誘導(dǎo)[22]。

以往大量研究表明，乙烯菌核利可以抑制ar轉(zhuǎn)活及ar依賴性基因的表達(dá)，從而干擾雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育及功能[23]。本研究中，雄性稀有鮈鯽性腺中ar基因(10 μg·L-1)及dmrt1基因(所有濃度組)的轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低，表明乙烯菌核利對(duì)ar介導(dǎo)的信號(hào)通路的確有抑制作用。Martinovic等[13]則發(fā)現(xiàn)黑頭呆魚(yú)(Pimephales promelas)暴露于450 μg·L-1乙烯菌核利后，其精巢組織中ar mRNA的表達(dá)顯著增加。這種差異可能與暴露濃度以及物種敏感性等因素相關(guān)。本研究中雄魚(yú)性腺組織切片和GSI均沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的變化。Baatrup和Junge[11]對(duì)虹鳉(Poecilia reticulate)的研究顯示，雖然GSI等指標(biāo)沒(méi)有明顯變化，但乙烯菌核利對(duì)雄魚(yú)的精子數(shù)量和質(zhì)量均產(chǎn)生了顯著的影響。因此，本研究中乙烯菌核利有可能通過(guò)抑制ar信號(hào)通路對(duì)稀有鮈鯽精巢組織產(chǎn)生了其他未觀測(cè)到的影響(如精子數(shù)量和質(zhì)量下降等)。

相反，雌魚(yú)性腺中ar轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，但dmrt1轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)生顯著變化，同時(shí)er、vtg的轉(zhuǎn)錄水平也顯著升高。雖然AR在魚(yú)類卵巢中的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制尚未明晰，但有證據(jù)顯示，雄激素可以通過(guò)與AR直接反應(yīng)抑制VTG的合成[13]。乙烯菌核利也可能與雄激素競(jìng)爭(zhēng)受體，導(dǎo)致ar基因轉(zhuǎn)錄水平升高，并加劇對(duì)VTG合成的抑制，從而導(dǎo)致雌性稀有鮈鯽卵泡發(fā)育受到阻礙。而er、vtg的轉(zhuǎn)錄水平的升高，則可能是VTG合成受到抑制后的補(bǔ)償效應(yīng)。

雌雄魚(yú)對(duì)環(huán)境污染物的敏感性和響應(yīng)機(jī)制上的差異，已經(jīng)有過(guò)多次報(bào)道[12]。筆者在前期的研究中也發(fā)現(xiàn)，稀有鮈鯽雌魚(yú)腎上腺系統(tǒng)對(duì)乙烯菌核利暴露的敏感性高于雄魚(yú)[24]。這可能與體內(nèi)激素水平有關(guān)，以本研究為例：雄魚(yú)體內(nèi)具有較高的雄激素及ar mRNA表達(dá)水平，乙烯菌核利直接表現(xiàn)出對(duì)ar及其依賴性信號(hào)通路的抑制作用；而雌魚(yú)體內(nèi)雄激素及ar轉(zhuǎn)錄水平都非常低，乙烯菌核利可更有效地競(jìng)爭(zhēng)雄激素受體，導(dǎo)致受體供應(yīng)不足，誘導(dǎo)ar的表達(dá)增加。當(dāng)然，其中具體的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上，環(huán)境濃度下乙烯菌核利短期暴露會(huì)對(duì)稀有鮈鯽生殖系統(tǒng)產(chǎn)生一定的影響，但在轉(zhuǎn)錄水平上表現(xiàn)出不同的分子機(jī)制，且雌魚(yú)的敏感性大于雄魚(yú)。在以后的內(nèi)分泌干擾研究中，應(yīng)充分考慮受試動(dòng)物的性別、發(fā)育階段等因素可能帶來(lái)的影響。

[1] United States Environmental Protection Agency (US EPA). Reregistration Eligibility Decision for Vinclozolin [R]. Washington DC: Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances, 2000

[2] Steeger T, Garber K. Risks of Vinclozolin Use to Federally Threatened California Red-Legged Frog (Rana aurora draytonii) [R]. Washington DC: Office of Pesticide Programs, Environmental Fate and Effects Division, 2009

[3] Oskam G, Van G J, Hopman R, et al. General view of the problem, with special reference to the Dutch situation [J]. Water Supply, 1993, 11(1): 1-17

[4] European Commission. Communication to the Council and the European Parliament on the Implementation of the Community Strategy for Endocrine Disrupters-A Range of Substances Suspected of Interfering with the Hormone Systems of Humans and Wildlife [R]. Brussels: Commission of the European Communities, 2001

[5] United States Environmental Protection Agency (US EPA). Contaminant Candidate List 3 [R]. Washington DC: Office of Ground Water and Drinking Water, 2009

[6] Kelce W R, Lambright C R, Gray Jr L E, et al. Vinclozolin and p,p'-DDE alter androgen-dependent gene expression: In vivo confirmation of an androgen receptor-mediated mechanism [J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 1997, 142(1): 192-200

[7] Gray L E, Ostby J. Effects of pesticides and toxic substances on behavioral and morphological reproductive development: Endocrine versus nonendocrine mechanisms [J]. Toxicology and Industrial Health, 1998, 14(1-2): 159-184

[8] Roberts K P, Zirkin B R. Androgen regulation of spermatogenesis in the rat [J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 1991, 637(1): 90-106

[9] Gray L E, Ostby J, Furr J, et al. Effects of environmental antiandrogens on reproductive development in experimental animals [J]. Human Reproduction Updata, 2001, 7(3): 248-264

[10] Uzumcu M, Suzuki H, Skinner M K. Effect of the anti-androgenic endocrine disruptor vinclozolin on embryonic testis cord formation and postnatal testis development and function [J]. Reproductive Toxicology, 2004, 18(6): 765-774

[11] Baatrup E, Junge M. Antiandrogenic pesticides disrupt sexual characteristics in the adult male guppy (Poecilia reticulata) [J]. Environmental Health Perspectives, 2001, 109(10): 1063-1070

[12] Makynen E A, Kahl M D, Jensen K M, et al. Effects of the mammalian antiandrogen vinclozolin on the development and reproduction of the fathead minnow (Pimephales promelas) [J]. Aquatic Toxicology, 2000, 48(4): 461-475

[13] Martinovic D, Blake L S, Durhan E J, et al. Reproductive toxicity of vinclozolin in the fathead minnow: Confirming an anti-androgenic mode of action [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2008, 27(2): 478-488

[14] Zhong X P, Xu Y, Liang Y, et al. The Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) as an in vivo model for endocrine disruption in freshwater teleosts: A full life-cycle test with diethylstilbestrol [J]. Aquatic Toxicology, 2005, 71(1): 85-95

[15] Zhang X Y, Zha J M, Wang Z J. Influences of 4-nonylphenol on dmrt1 gene expression and vitellogenin mRNA induction of adult rare minnow (Gobiocypris rarus) [J]. Environental Toxicology and Chemistry, 2008, 27(1): 196-205

[16] Van der Oost R, Beyer J, Vermeulen N P E. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: A review [J]. Environmental Toxicology Pharmacololy, 2003, 13(2): 57-149

[17] Deng J, Liu C S, Yu L Q, et al. Chronic exposure to environmental levels of tribromophenol impairs zebrafish reproduction [J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2010, 243(1): 87-95

[18] Quignot N, Arnaud M, Robidel F, et al. Characterization of endocrine-disrupting chemicals based on hormonal balance disruption in male and female adult rats [J]. Reproductive Toxicology, 2012, 33(3): 339-352

[19] Bayley M, Larsen P F, Baekgaard H, et al. The effects of vinclozolin, an anti-androgenic fungicide, on male guppy secondary sex characters, and reproductive success [J]. Biology of Reproduction, 2003, 69(6): 1951-1956

[20] Kiparissis Y, Metcalfe T L, Balch G C, et al. Effects of the antiandrogens, vinclozolin and cyproterone acetate on gonadal development of the Japanese medaka (Oryzias latipes) [J]. Aquatic Toxicology, 2003, 63(4): 391-403

[21] Nagahama Y, Yamashita M. Regulation of oocyte maturation in fish [J]. Development, Growth & Differentiation, 2008, 50(s1): S195-S219

[22] Wang H, Tan J T T, Emelyanov A, et al. Hepatic and extrahepatic expression of vitellogenin genes in the zebrafish, Danio rerio [J]. Gene, 2005, 356: 91-100

[23] Kelce W R, Gray L E, Wilson E M. Antiandrogens as environmental endocrine disruptors [J]. Reproduction, Fertility and Development, 1998, 10(1): 105-111

[24] Yang L H, Zha J M, Zhang X Y, et al. Vinclozolin affects the interrenal system of rare minnow (Gobiocypris rarus) [J]. Aquatic Toxicology, 2011, 104(1-2): 153-159

◆

VinclozolinAffectedtheGonadofRareMinnow(Gobiocyprisrarus)atHistopathologicalandTranscriptionalLevels

Yang Lihua, Zha Jinmiao*, Wang Zijian

State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

16 July 2013accepted15 September 2013

Vinclozolin has been proved as a mammalian anti-androgen. However, data concerning its effects in fish is limited. In the present study, sexually matured rare minnow were exposed to environmentally relevant concentrations of vinclozolin (0, 2, 10, 50 μg·L-1) for 21 days. In the females, the hepatosomatic index (HSI) and gonadsomatic index (GSI) were significantly decreased at all treatments (p<0.05), and the development of ovarian follicles were inhibited; while in the males, no obvious changes were observed except for a decrease of HSI at 50 μg·L-1(p<0.05). Real-time PCR revealed significant increases of the gonadal transcripts of er (50 μg·L-1), vtg (10, 50 μg·L-1), and ar (all concentrations) in the females (p<0.05), but decreases of those of ar (10 μg·L-1), dmrt1 (all concentrations) and er (all concentrations) in the males (p<0.05). Above all, short term exposure to vinclozolin at environmentally relevant concentrations could cause adverse effects on the gonad of rare minnow. The results also indicated differences in the sensitivity and responsive mechanism upon vinclozolin exposure, which should be considered in further studies on other endocrine disrupting chemicals.

vinclozolin; rare minnow; gonad; transcription

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863計(jì)劃”重大項(xiàng)目(2012AA06A302)

楊麗華(1984-)，女，博士，研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理學(xué)，E-mail: lhyang@ihb.ac.cn

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: jmzha@rcees.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20130716001

楊麗華，查金苗，王子健. 乙烯菌核利對(duì)稀有鮈鯽性腺組織及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2014, 9(2): 245-252

Yang L H, Zha J M, Wang Z J. Vinclozolin affected the gonad of rare minnow at histopathological and transcriptional levels (Gobiocypris rarus) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(2): 245-252 (in Chinese)

2013-07-16錄用日期2013-09-15

1673-5897(2014)2-245-08

X171.5

A

查金苗(1975—)，男，博士，副研究員，主要研究興趣包括水生模型生物體系的構(gòu)建和發(fā)展、水環(huán)境生物毒性測(cè)試方法、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的篩選技術(shù)研究、環(huán)境污染物對(duì)水生生物分子毒理機(jī)制和水生態(tài)系統(tǒng)完整性評(píng)估方法等，在國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表高水平論文50余篇，SCI論文30余篇。