王擺，高士博,2，董穎，王笑月，周遵春,*

1. 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，大連 116023 2. 大連海洋大學(xué)，大連 116023

6種苯系物對球等鞭金藻和新月菱形藻的生長抑制

王擺1，高士博1,2，董穎1，王笑月1，周遵春1,*

1. 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，大連 116023 2. 大連海洋大學(xué)，大連 116023

海洋環(huán)境中苯系物污染主要來源于海洋溢油事故以及沿海石油化工企業(yè)的廢水排放。為探究苯系物對海洋微藻的毒性作用，選擇球等鞭金藻和新月菱形藻作為受試生物，分別考察了苯、甲苯、乙基苯、鄰-二甲苯、間-二甲苯和對-二甲苯6種苯系物對2種海洋微藻生長的影響。結(jié)果表明，在0.25～64.0 mg·L-1暴露濃度下，6種苯系物對2種微藻生長具有顯著的抑制作用，隨著暴露濃度的升高，抑制作用明顯增強(qiáng)。苯、甲苯、乙基苯、鄰-二甲苯、間-二甲苯、對-二甲苯對球等鞭金藻的24 h的半數(shù)效應(yīng)濃度(24 h-EC50)分別為：17.07、12.88、7.58、0.55、0.36、0.27 mg·L-1；對新月菱形藻的24 h-EC50值分別為：1.03、0.68、0.46、0.40、0.42、0.38 mg·L-1。上述研究結(jié)果為確定苯系物海洋環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、保護(hù)海洋生態(tài)環(huán)境提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

苯系物；球等鞭金藻；新月菱形藻；生長抑制；毒性作用

苯系物(BTEX)是苯(Benzene)、甲苯(Toluene)、乙基苯(Ethyl benzene)、二甲苯(Xylene)的統(tǒng)稱[1]，作為全球生產(chǎn)和使用最廣泛的50種化合物之一，已被美國環(huán)保署(USEPA)列為現(xiàn)階段優(yōu)先控制對象，其相關(guān)的環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)較為完備。相比之下，苯系物列入我國集中式生活飲用水地表水源地特定檢測項目，有關(guān)海洋環(huán)境中苯系物的環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)尚屬空白。

海洋環(huán)境中苯系物污染主要來源于海洋溢油事故以及沿海石油化工企業(yè)的廢水排放。石油中水溶性單環(huán)芳烴占89%，其中苯系物就占到87.6%[2]。2008年我國進(jìn)口石油2億噸的90%經(jīng)海洋運(yùn)輸[3]。2010年大連“7.16溢油”[4]和2011年蓬萊“19-3溢油”事故中[5]，苯系物是一類重要的污染因子。近年來，我國對-二甲苯(PX)產(chǎn)能逐年升高，至2010年達(dá)到802.37萬噸/年，而我國PX和對苯二甲酸(PTA)生產(chǎn)企業(yè)主要分布在沿海地區(qū)，2010年沿海地區(qū)的PTA總產(chǎn)能占全國總產(chǎn)能的72.6%[6]。PX和PTA工業(yè)廢水主要成分包括苯、二甲苯等，是較難處理的石油化工廢水。苯系物進(jìn)入海洋環(huán)境主要存在于表層海水和沉積物中。表層海水中苯系物因揮發(fā)、光解、微生物的降解作用，其濃度通常在ng·L-1水平[7-8]。Cavalcante等[9]發(fā)現(xiàn)在港口表層海水苯系物濃度可以達(dá)到μg·L-1。海水中苯系物隨著中顆粒物質(zhì)沉降，在海洋沉積物中累積，致使海洋沉積物中苯系物含量可以達(dá)到mg·kg-1[10-12]。苯是已知的致癌物，甲苯和乙基苯具有致畸致突變作用，二甲苯具有致畸作用[1]。因此，亟需開展苯系物的海洋環(huán)境基準(zhǔn)研究。根據(jù)美國環(huán)保署相關(guān)規(guī)定，環(huán)境基準(zhǔn)的確定至少需要5～8種不同屬生物毒理學(xué)數(shù)據(jù)，其中浮游植物毒理學(xué)數(shù)據(jù)是不可或缺的。

海洋微藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者，約占海洋生物物種的40.86%[13]，是整個海洋食物鏈的基礎(chǔ)，也是魚、蝦、貝的餌料生物，開展污染物對海洋微藻的毒性作用研究具有非常重要的意義[14]。大量研究表明海洋微藻對重金屬、農(nóng)藥、有機(jī)污染物等較為敏感[15-17]，可作為有機(jī)污染物和無機(jī)污染物的指示生物[18]。許多國家已建立藻類毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法，廣泛應(yīng)用于污染物的毒性作用評價。江玉等[19]報道了甲苯對6種海洋微藻的毒性作用，而有關(guān)6種苯系物對球等鞭金藻和新月菱形藻的毒性作用研究尚未見報道。

依據(jù)苯系物在海洋環(huán)境中的分布特征和海洋浮游生物在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用，本研究選擇球等鞭金藻和新月菱形藻作為受試微藻，開展了苯、甲苯、乙基苯、鄰-二甲苯、間-二甲苯和對-二甲苯6種苯系物對海洋微藻的毒性作用研究，以期為確定我國海洋環(huán)境苯系物的環(huán)境基準(zhǔn)、保護(hù)海洋生態(tài)環(huán)境提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用球等鞭金藻(Isochrysis galbana)和新月菱形藻(Nitzschia closterium)取自遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，藻種經(jīng)活化后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2種微藻的培養(yǎng)基為f/2液體培養(yǎng)基，球等鞭金藻培養(yǎng)條件為：溫度(25±0.2) ℃，鹽度30.0，pH 7.8，光暗比為12 h∶12 h，白周期光照強(qiáng)度3 000 lux；新月菱形藻的培養(yǎng)條件為：溫度(15±0.2) ℃，鹽度30.0，pH 7.8，光暗比為12 h:12 h，白周期光照強(qiáng)度3 000 lux。

實(shí)驗(yàn)用苯、甲苯、乙基苯、鄰-二甲苯、間-二甲苯、對-二甲苯及二甲基亞砜(DMSO)均為化學(xué)純，購自中國國藥有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法參照《化學(xué)品藻類生長抑制試驗(yàn)》(GB/T 21805—2008)[20]。苯的暴露濃度設(shè)置為1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg·L-1，甲苯、乙基苯、鄰-二甲苯、間-二甲苯、對-二甲苯的暴露濃度設(shè)置為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 mg·L-1，用二甲基亞砜配制6種苯系物各暴露濃度1 000倍的實(shí)驗(yàn)?zāi)敢?。?00 mL玻璃三角燒瓶中，用滅菌f/2液體培養(yǎng)基和苯系物的實(shí)驗(yàn)?zāi)敢?200 μL)配制200 mL暴露溶液，同時設(shè)置空白對照組和助溶劑對照組，助溶劑濃度為0.1%(體積比)，每組設(shè)置3個平行樣，2種藻的初始接種密度均為7.7×104cells·mL-1。暴露實(shí)驗(yàn)開始后，每天測1次藻液的細(xì)胞密度，試驗(yàn)重復(fù)1次。

藻液的細(xì)胞密度測量采用鏡檢法結(jié)合分光光度法，通過光譜掃描獲得2種微藻的最佳吸收波長，用血球計數(shù)板鏡檢藻細(xì)胞密度，并在其最佳吸收波長處測定藻液的吸光值，繪制2種藻的細(xì)胞密度—吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

6種苯系物對球等鞭金藻和新月菱形藻24 h、48 h、72 h-EC50值的計算方法參照化學(xué)品對藻類的生長抑制試驗(yàn)方法[20]。首先計算苯系物對微藻生長抑制率(GIR)，再進(jìn)行生長抑制率與苯系物暴露濃度的回歸分析，用插值法計算出24 h、48 h、72 h-EC50值。

GIR = (Ccont- CBTEX)/Ccont×100%

公式中：Ccont為對照組藻細(xì)胞密度，CBTEX為苯系物暴露組藻細(xì)胞密度。

采用SPSS 13.0軟件(SPSS Inc.)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和回歸分析。采用ANOVA方法分析苯系物暴露組與空白對照組之間的差異，p < 0.05表示差異顯著；p < 0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

通過方差分析發(fā)現(xiàn)助溶劑對照組與空白對照組中的球等鞭金藻、新月菱形藻的生長無顯著差異，表明0.1%的二甲基亞砜對2種微藻的生長沒有影響。以下分析6種苯系物對2種微藻生長的影響時，選取空白對照組作為參照。2.1 6種苯系物對球等鞭金藻和新月菱形藻的生長抑制

6種苯系物對球等鞭金藻的生長抑制率影響見圖2，試驗(yàn)結(jié)果表明：1.0～32.0 mg·L-1的苯，1.0～64.0 mg·L-1的甲苯、乙基苯、0.25～64.0 mg·L-1的鄰-二甲苯、間-二甲苯、對-二甲苯對球等鞭金藻的生長具有顯著的抑制作用，隨著暴露濃度的增加，生長抑制率升高，存在顯著的劑量-效應(yīng)正相關(guān)性。

6種苯系物對新月菱形藻的生長抑制率影響見圖3，試驗(yàn)結(jié)果表明：1.0～32.0 mg·L-1苯，0.25～32.0 mg·L-1甲苯、乙基苯，間-二甲苯，0.25～16.0 mg·L-1鄰-二甲苯、對-二甲苯對新月菱形藻的生長同樣具有顯著的抑制作用。隨著暴露濃度的增加，生長抑制率升高，存在顯著的劑量-效應(yīng)正相關(guān)性。

圖1 球等鞭金藻(Isochrysis galbana)和新月菱形藻(Nitzschia closterium)的藻細(xì)胞密度—吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 The standard curve of cell density of Isochrysis galbana and Nitzschia closterium to light absorption value

圖2 6種苯系物對球等鞭金藻的生長抑制Fig. 2 Inhibitory effect of six kinds of BTEX on growth of I. galbana

圖3 6種苯系物對新月菱形藻的生長抑制Fig. 3 Inhibitory effect of six kinds of BTEX on growth of N. closterium

2.2 6種苯系物對球等鞭金藻和新月菱形藻的EC50值 通過計算6種苯系物對2種微藻24 h、48 h、72 h-EC50值(見表1)發(fā)現(xiàn)：苯在3個時間點(diǎn)對球等鞭金藻生長具有顯著抑制作用，其中48 h的抑制作用最強(qiáng)；苯在3個時間點(diǎn)對新月菱形藻生長具有顯著抑制作用，其中，24 h的抑制作用最強(qiáng)。甲苯、乙苯、鄰-二甲苯、間-二甲苯、對-二甲苯對2種微藻的抑制作用在24 h最強(qiáng)，隨著暴露時間延長，對2種微藻的生長抑制作用減弱，72 h-EC50值顯著升高。其中，對-二甲苯對球等鞭金藻的抑制作用下降最快。

表1 6種苯系物對球等鞭金藻和新月菱形藻的EC50值Table 1 EC50 value of six kinds of BTEX to I. galbana and N. closterium

通過對比6種苯系物對球等鞭金藻和新月菱形藻24 h、48 h、72 h-EC50值，發(fā)現(xiàn)苯、甲苯、乙基苯對新月菱形藻24 h-EC50值低于球等鞭金藻的，兩者之間相差16.4～18.9倍左右，表明在24 h，苯、甲苯、乙基苯對新月菱形藻的生長抑制作用遠(yuǎn)大于對球等鞭金藻的；二甲苯的3種同分異構(gòu)體對2種微藻的24 h-EC50值無顯著差異。二甲苯對新月菱形藻72 h-EC50值要低于球等鞭金藻的。

目前，有關(guān)苯系物的生態(tài)毒理學(xué)研究大部分涉及陸生動物和淡水生物[1]。李崇磊等[21-22]等發(fā)現(xiàn)苯、甲苯、二甲苯混合暴露導(dǎo)致小鼠肺臟和腦組織的氧化損傷，造成小鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降。范亞維等[23-24]開展了甲苯、乙苯、二甲苯對斑馬魚(Brachydanio rerio)、大型溞(Daphnia magna)和霍甫水絲蚓(Limnodrilus hoffmeisteri)的毒性效應(yīng)研究，結(jié)果表明，甲苯、乙苯和二甲苯對斑馬魚、大型溞和霍甫水絲蚓具有較強(qiáng)的毒性效應(yīng)，并存在顯著的劑量-效應(yīng)正相關(guān)性。6種苯系物對球等鞭金藻和新月菱形藻的生長有顯著抑制作用，存在顯著的劑量-效應(yīng)正相關(guān)性。江玉等[19]報道了4種芳烴對6種微藻的毒性作用，其中甲苯對小新月菱形藻(Nitzschia closterium minutissima)、甲藻(Zooxanthella microadriz tica)、三角褐指藻(Pheodactylum tricornutum)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)、小球藻(Chlorella vulgaris)和亞心形扁藻(Platymonas subcordiformis)的72 h-EC50分別為：34.1、35.6、38.3、36.7、98.6、114.0 mg·L-1。本文發(fā)現(xiàn)甲苯對球等鞭金藻和新月菱形藻的72 h-EC50分別為37.66、20.87 mg·L-1。此外，6苯系物對球等鞭金藻和新月菱形藻的EC50值與其logKow值有較好的相關(guān)性，這與江玉等[19]的研究結(jié)論一致。

致謝：感謝遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院赫崇波研究員在文章修改中給予的幫助。

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◆

InhibitoryEffectofSixKindsofBTEXsonGrowthoftheChrysophyceaeIsochrysisgalbanaandtheDiatomNitzschiaclosterium

Wang Bai1, Gao Shibo1,2, Dong Ying1, Wang Xiaoyue1, Zhou Zunchun1,*

1. Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116023, China 2. Dalian Ocean University, Dalian 116023, China

10 April 2013accepted25 June 2013

The marine pollution of benzene series (BTEXs), including benzene, toluene, ethyl benzene and xylene, is mainly from the marine oil spill and coastal petrochemical wastewater discharge. In order to reveal the toxic effect of BTEXs on marine microalgae, the chrysophyceae Isochrysis galbana and the diatom Nitzschia closterium were exposed to benzene, toluene, ethyl benzene, o-xylene, m-xylene and p-xylene, and their growth rates were detected. The results showed that the growth of I. galbana and N. closterium were inhibited dramatically by the BTEXs at the exposed concentration from 0.25 to 64.0 mg·L-1. The growth inhibition was enhanced with the concentration of BTEXs in well dose-effect manner. The 24 h-EC50of benzene, toluene, ethyl benzene, o-xylene, m-xylene and p-xylene to I. galbana was 17.07, 12.88, 7.58, 0.55, 0.36 and 0.27 mg·L-1. The 24 h-EC50of the corresponding BTEXs to N. closterium was 1.03, 0.68, 0.46, 0.40, 0.42 and 0.38 mg·L-1. The results presented in this study will provide basic data for establishing marine environmental quality criteria of BTEXs and protecting the marine ecological environment.

BTEX; Isochrysis galbana; Nitzschia closterium; growth inhibition; toxic effect

海洋公益性行業(yè)科研專項 (201205012-7)；大連市科學(xué)技術(shù)基金(2012J21DW029)

王擺(1981-)，男，助理研究員，研究方向?yàn)楹Ｑ笊鷳B(tài)毒理學(xué)，E-mail: wangbai1980@hotmail.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: zunchunz@hotmail.com

10.7524/AJE.1673-5897.20130410001

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2013-04-10錄用日期2013-06-25

1673-5897(2014)2-233-06

X171.5

A

周遵春(1967—)，男，海洋生物學(xué)博士，研究員，主要研究方向海洋生物學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文90余篇。